Частыя пытанні па ПЦР 1. Ілжыва адмоўны, не з'яўляецца паласа ампліфікацыі 2. Ілжыва станоўчы 3. З'яўляюцца неспецыфічныя палосы ампліфікацыі 4. З'яўляюцца лускаватыя палоскі перацягвання або мазкі:
1 Ілжыва адмоўны вынік, паласа ўзмацнення не з'яўляецца. Ключавымі аспектамі рэакцыі ПЦР з'яўляюцца
① падрыхтоўка матрычнай нуклеінавай кіслаты
② праймер якасці і спецыфічнасці
③ якасць ферментаў і
④ Умовы цыклу ПЦР.Каб знайсці прычыны, таксама варта правесці аналіз і даследаванне па прыведзеных вышэй спасылках.
Шаблон:
① Шаблон змяшчае бялкі-прымешкі
② Шаблон змяшчае інгібітары фермента Taq
③ Вавёркі ў шаблоне не пераварваюцца і не выдаляюцца, асабліва гістоны ў храмасомах
④ Занадта шмат было страчана падчас здабывання і падрыхтоўкі шаблону, або фенол быў удыхнуты
⑤Матрычная нуклеінавая кіслата не цалкам дэнатураваная.Калі якасць ферментаў і праймераў добрая, калі палосы ампліфікацыі не з'яўляюцца, хутчэй за ўсё, нешта не так з працэсам пераварвання ўзору або працэсам экстракцыі матрычнай нуклеінавай кіслаты.Такім чынам, неабходна падрыхтаваць эфектыўны і стабільны раствор для стрававання, а працэдура павінна быць фіксаванай і не павінна змяняцца па жаданні..Інактывацыя фермента: неабходна замяніць новы фермент або адначасова выкарыстоўваць стары і новы ферменты, каб прааналізаваць, ці выкліканы ілжывыя адмоўныя вынікі стратай або недастатковай актыўнасцю фермента.Варта адзначыць, што часам пра фермент Taq забываюць. Праймеры: якасць праймераў, канцэнтрацыя праймераў і сіметрычнасць канцэнтрацый двух праймераў з'яўляюцца агульнымі прычынамі няўдачы ПЦР або нездавальняючых палос ампліфікацыі і лёгкай дыфузіі.Ёсць праблемы з якасцю сінтэзу грунтоўкі ў некаторых партыях.Адзін з двух праймераў мае высокую канцэнтрацыю, а другі - нізкую, што прыводзіць да нізкай эфектыўнасці асіметрычнага ўзмацнення.
Супрацьмеры:
① Выберыце добры блок сінтэзу грунтоўкі.
② Пры канцэнтрацыі праймераў трэба не толькі звярнуць увагу на значэнне OD, але і звярнуць увагу на асноўны раствор праймера для электрафарэзу ў агарозным гелі.Павінны быць паласы грунтоўкі, і яркасць дзвюх палос грунтоўкі павінна быць прыкладна аднолькавай.Напрыклад, адна грунтоўка мае паласу, а другая не мае паласы.Для палосак ПЦР у гэты момант можа не даць выніку, і гэта трэба вырашыць шляхам перамоваў з блокам сінтэзу праймераў.Калі адзін праймер мае высокую яркасць, а другі - нізкую, збалансуйце канцэнтрацыі пры развядзенні праймераў.
③ Праймеры трэба захоўваць у высокай канцэнтрацыі і ў невялікіх колькасцях, каб прадухіліць паўторнае замарожванне і адтаванне або працяглае захоўванне ў халадзільніку, што можа прывесці да пагаршэння якасці і дэградацыі праймераў.
④Канструкцыя праймера неабгрунтаваная, напрыклад, даўжыня праймера недастатковая, паміж праймерамі ўтвараюцца дымеры і г. д. Канцэнтрацыя Mg2+: канцэнтрацыя іёнаў Mg2+ моцна ўплывае на эфектыўнасць ампліфікацыі ПЦР.Калі канцэнтрацыя занадта высокая, гэта можа знізіць спецыфічнасць ПЦР-ампліфікацыі.Калі канцэнтрацыя занадта нізкая, гэта паўплывае на вынік ПЦР-ампліфікацыі і нават прывядзе да збою ПЦР-ампліфікацыі без узмацняльных палос.Змены ў рэакцыйным аб'ёме: звычайна для ПЦР-ампліфікацыі выкарыстоўваюцца аб'ёмы 20 мкл, 30 мкл і 50 мкл.Або 100 мкл, які аб'ём трэба выкарыстоўваць для ПЦР-ампліфікацыі, усталёўваецца ў адпаведнасці з рознымі мэтамі навуковых даследаванняў і клінічных выпрабаванняў.Зрабіўшы невялікі аб'ём, напрыклад, 20 мкл, а затым зрабіўшы большы аб'ём, вы павінны прытрымлівацца ўмоў, інакш ён лёгка выйдзе з ладу.Фізічныя прычыны: дэнатурацыя вельмі важная для ПЦР-ампліфікацыі.Калі тэмпература дэнатурацыі нізкая і час дэнатурацыі кароткі, вялікая верагоднасць узнікнення ілжывых адмоўных вынікаў;тэмпература адпалу занадта нізкая, што можа выклікаць неспецыфічнае ўзмацненне і знізіць удзельную эфектыўнасць узмацнення.Тэмпература адпалу занадта высокая.Моцна ўплывае на звязванне праймераў з матрыцамі і зніжае эфектыўнасць ампліфікацыі ПЦР.Часам неабходна выкарыстоўваць стандартны тэрмометр для праверкі тэмпературы дэнатурацыі, адпалу і пашырэння ва ўзмацняльніку або вадараспушчальным посудзе.Гэта таксама адна з прычын няўдачы ПЦР.Варыяцыя паслядоўнасці-мішэні: калі паслядоўнасць-мішэнь мутаваная або выдаленая, што ўплывае на спецыфічнае звязванне праймера з шаблонам, або праймер і шаблон губляюць камплементарную паслядоўнасць з-за выдалення пэўнага сегмента паслядоўнасці-мішэні, ПЦР-ампліфікацыя не будзе паспяховым.
2.ілжывададатны. Паласа ампліфікацыі ПЦР, якая з'яўляецца, адпавядае паласе мэтавай паслядоўнасці, а часам паласа больш упарадкаваная і ярчэйшая.Неадпаведная канструкцыя праймера: абраная паслядоўнасць ампліфікацыі мае гамолагі з немэтавай паслядоўнасцю ампліфікацыі, таму пры выкананні ПЦР-ампліфікацыі ампліфікаваны прадукт ПЦР з'яўляецца нямэтавай паслядоўнасцю.Калі мэтавая паслядоўнасць занадта кароткая або праймер занадта кароткі, могуць лёгка адбыцца ілжывыя спрацоўванні.Буквары трэба перарабіць.Перакрыжаванае забруджванне мэтавых паслядоўнасцей або прадуктаў ампліфікацыі: ёсць дзве прычыны гэтага забруджвання: па-першае, перакрыжаванае заражэнне ўсяго геному або вялікіх фрагментаў, што прыводзіць да ілжывых спрацоўванняў.Гэта ілжывае спрацоўванне можна ліквідаваць наступнымі метадамі: Будзьце асцярожныя і далікатныя падчас працы, каб прадухіліць засмоктванне мэтавай паслядоўнасці ў пісталет для ўзору або выплюхванне з цэнтрыфужнай прабіркі.За выключэннем ферментаў і рэчываў, якія не вытрымліваюць высокіх тэмператур, усе рэагенты і абсталяванне неабходна стэрылізаваць пад высокім ціскам.Усе цэнтрыфужныя прабіркі і наканечнікі піпетак для ўвядзення ўзораў трэба выкарыстоўваць адзін раз.Пры неабходнасці рэакцыйныя прабіркі і рэагенты апрамяняюць ультрафіялетавым святлом перад даданнем узору для разбурэння прысутных нуклеінавых кіслот.Другая - забруджванне паветра невялікімі фрагментамі нуклеінавых кіслот.Гэтыя невялікія фрагменты карацей мэтавай паслядоўнасці, але маюць пэўную гамалогію.Іх можна злучыць адзін з адным, і пасля таго, як яны дапаўняюць праймеры, прадукты ПЦР могуць быць узмоцнены, што прыводзіць да ілжывых спрацоўванняў, якія можна паменшыць або ліквідаваць метадамі ўкладзенай ПЦР.
3. З'яўляюцца неспецыфічныя палосы ампліфікацыі Палосы, якія з'яўляюцца пасля ПЦР-ампліфікацыі, не адпавядаюць чаканаму памеру, альбо большыя, альбо меншыя, або адначасова з'яўляюцца як спецыфічныя, так і неспецыфічныя палосы ампліфікацыі.Прычыны з'яўлення неспецыфічных палос: па-першае, праймеры не цалкам камплементарныя паслядоўнасці-мішэні, або праймеры аб'ядноўваюцца з адукацыяй дымераў.Другая прычына ў тым, што канцэнтрацыя іёнаў Mg2+ занадта высокая, тэмпература адпалу занадта нізкая і колькасць цыклаў ПЦР занадта вялікая.Другі фактар - гэта якасць і колькасць фермента.Ферменты з некаторых крыніц часта схільныя да неспецыфічных палос, а ферменты з іншых крыніц - не.Залішняя колькасць ферментаў часам можа прывесці да неспецыфічнага ўзмацнення.Меры процідзеяння ўключаюць у сябе: пры неабходнасці перарабіць грунтоўкі.Паменшыце колькасць фермента або заменіце яго іншай крыніцай.Паменшыце колькасць праймераў, адпаведна павялічце колькасць шаблонаў і паменшыце колькасць цыклаў.Адпаведна павялічце тэмпературу адпалу або выкарыстоўвайце метад дзвюх тэмпературных кропак (дэнатурацыя пры 93°C, адпал і падаўжэнне каля 65°C).
4. З'яўляюцца лускаватыя плямы або мазкі. ПЦР-ампліфікацыя часам выглядае ў выглядзе размазаных палос, лістападобных або дывановых палос.Прычыны часта выкліканы занадта вялікай колькасцю фермента або нізкай якасцю фермента, занадта высокай канцэнтрацыяй dNTP, занадта высокай канцэнтрацыяй Mg2+, занадта нізкай тэмпературай адпалу і занадта вялікай колькасцю цыклаў.Контрмеры ўключаюць: ① Паменшыце колькасць фермента або заменіце фермент іншай крыніцай.②Паменшыце канцэнтрацыю dNTP.Адпаведным чынам знізіць канцэнтрацыю Mg2+.Павялічце колькасць шаблонаў і паменшыце колькасць цыклаў