FAQ sa PCR 1. False negatibo, walay amplification band nga makita 2. False positive 3. Non-specific amplification bands makita 4. Flaky drag strips o smear strips makita:
1Sayop nga negatibo, walay gipakusog nga banda nga makita Ang mga importanteng aspeto sa reaksyon sa PCR mao ang
① pag-andam sa template nucleic acid
② primerong kalidad ug espesipiko
③ kalidad sa enzyme ug
④ Mga kondisyon sa siklo sa PCR.Aron mahibal-an ang mga hinungdan, pagtuki ug panukiduki kinahanglan usab nga himuon sa mga link sa ibabaw.
Template:
① Ang template adunay mga protina sa kahugawan
② Ang template adunay Taq enzyme inhibitors
③ Ang mga protina sa template dili matunaw ug makuha, labi na ang mga histone sa mga chromosome
④ Daghan kaayo ang nawala sa panahon sa pagkuha ug pag-andam sa template, o phenol ang gihanggab
⑤Ang template nga nucleic acid dili hingpit nga ma-denatured.Kung maayo ang kalidad sa mga enzyme ug primer, kung dili makita ang mga amplification band, lagmit nga adunay usa ka butang nga sayup sa proseso sa pagtunaw sa espesimen o sa template nga proseso sa pagkuha sa nucleic acid.Busa, ang usa ka epektibo ug lig-on nga solusyon sa paghilis kinahanglan nga andamon, ug ang pamaagi kinahanglan nga ayohon ug dili kinahanglan nga usbon sa gusto..Enzyme inactivation: Kinahanglan nga ilisan ang bag-ong enzyme, o gamiton ang daan ug bag-ong mga enzyme sa parehas nga oras aron analisahon kung ang mga sayup nga negatibo tungod sa pagkawala o dili igo nga kalihokan sa enzyme.Kinahanglang matikdan nga usahay ang Taq enzyme makalimtan.Mga primera: Ang kalidad sa primera, primerong konsentrasyon, ug kon simetrikal ba ang mga konsentrasyon sa duha ka primera maoy kasagarang mga rason sa kapakyasan sa PCR o dili maayo nga amplification bands ug sayon nga pagsabwag.Adunay mga problema sa kalidad sa primer synthesis sa pipila ka mga batch.Ang usa sa duha nga mga primer adunay taas nga konsentrasyon ug ang lain adunay gamay nga konsentrasyon, nga miresulta sa ubos nga kahusayan nga asymmetric amplification.
Ang mga countermeasure mao ang:
① Pagpili ug maayong primer synthesis unit.
② Ang konsentrasyon sa mga primer kinahanglan dili lamang motan-aw sa OD nga kantidad, apan usab pagtagad sa primer stock solusyon alang sa agarose gel electrophoresis.Kinahanglang adunay primerong mga banda, ug ang kahayag sa duha ka primerong banda kinahanglang halos pareho ra.Pananglitan, ang usa ka primer adunay banda ug ang laing primer walay banda.Alang sa mga strips, ang PCR mahimong mapakyas niining panahona ug kinahanglang masulbad pinaagi sa negosasyon sa primer synthesis unit.Kung ang usa ka primer adunay taas nga kahayag ug ang lain adunay gamay nga kahayag, balansehon ang mga konsentrasyon sa pagtunaw sa mga primer.
③ Ang mga primer kinahanglan tipigan sa taas nga konsentrasyon ug gamay nga gidaghanon aron malikayan ang balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw o dugay nga pagtipig sa refrigerator, nga mahimong mosangpot sa pagkadaot ug pagkadaot sa mga primer.
④Ang disenyo sa primer dili makatarunganon, sama sa gitas-on sa primer dili igo, ang mga dimer naporma tali sa mga primer, ug uban pa. Konsentrasyon sa Mg2+: Ang konsentrasyon sa Mg2+ ion adunay dakong impluwensya sa kahusayan sa pagpadako sa PCR.Kung ang konsentrasyon labi ka taas, mahimo’g makunhuran ang piho nga pagpadako sa PCR.Kung ubos ra kaayo ang konsentrasyon, maapektuhan ang ani sa PCR amplification ug mapakyas pa gani ang PCR amplification nga walay pagpadako sa mga banda.Mga pagbag-o sa gidaghanon sa reaksyon: Kasagaran ang mga volume nga gigamit alang sa pagpadako sa PCR mao ang 20ul, 30ul, ug 50ul.O 100ul, unsa nga gidaghanon ang kinahanglan nga gamiton alang sa PCR amplification gitakda sumala sa lain-laing mga katuyoan sa siyentipikong panukiduki ug clinical testing.Human sa paghimo sa usa ka gamay nga gidaghanon, sama sa 20ul, ug unya sa paghimo sa usa ka mas dako nga gidaghanon, kamo kinahanglan gayud nga mosunod sa mga kondisyon, kon dili kini dali nga mapakyas.Pisikal nga mga rason: Ang denaturation importante kaayo para sa PCR amplification.Kung ang temperatura sa denaturation ubos ug ang oras sa denaturation mubo ra, ang mga sayup nga negatibo lagmit nga mahitabo;ubos kaayo ang temperatura sa annealing, nga mahimong hinungdan sa non-specific amplification ug makunhuran ang specific amplification efficiency.Taas kaayo ang temperatura sa annealing.Makaapektar pag-ayo sa pagbugkos sa mga primer sa mga templates ug makapamenos sa kahusayan sa pagpadako sa PCR.Usahay kinahanglan nga mogamit usa ka standard nga thermometer aron masusi ang denaturation, annealing ug extension nga temperatura sa amplifier o kaldero nga matunaw sa tubig.Usa usab kini sa mga hinungdan sa pagkapakyas sa PCR.Pagbag-o sa pagkasunod-sunod sa target: Kung ang target nga han-ay gi-mutate o gitangtang, nga makaapekto sa piho nga pagbugkos sa primer sa template, o ang primer ug template mawad-an sa komplementaryong pagkasunod-sunod tungod sa pagtangtang sa usa ka bahin sa target nga han-ay, ang PCR amplification dili magmalampuson.
2.false positive Ang PCR amplification band nga makita nahiuyon sa target sequence band, ug usahay ang banda mas hapsay ug mas hayag.Dili angay nga primerong disenyo: Ang pinili nga amplification sequence adunay homology nga adunay non-target nga amplification sequence, mao nga sa pagbuhat sa PCR amplification, ang amplified PCR product kay dili target sequence.Kung ang target nga han-ay mubo ra kaayo o ang primer mubo ra, ang mga sayup nga positibo dali nga mahitabo.Kinahanglang bag-ohon ang mga primera.Cross-contamination sa target sequence o amplification nga mga produkto: Adunay duha ka rason alang niini nga kontaminasyon: Una, cross-contamination sa tibuok genome o dagkong mga tipik, nga mosangpot sa sayop nga mga positibo.Kining sayop nga positibo mahimong masulbad pinaagi sa mosunod nga mga pamaagi: Pag-amping ug malumo sa pag-opera aron mapugngan ang target nga han-ay gikan sa pagsuyop sa sample gun o pagsabwag gikan sa centrifuge tube.Gawas sa mga enzyme ug mga sangkap nga dili makasugakod sa taas nga temperatura, ang tanan nga mga reagents o kagamitan kinahanglan nga isterilisado pinaagi sa taas nga presyur.Ang tanang centrifuge tubes ug sample injection pipette tips kinahanglang gamiton kausa.Kung gikinahanglan, ang mga tubo sa reaksyon ug mga reagents i-irradiated sa ultraviolet nga kahayag sa dili pa idugang ang specimen aron gub-on ang mga nucleic acid nga anaa.Ang ikaduha mao ang kontaminasyon sa gagmay nga mga tipik sa nucleic acid sa hangin.Kini nga gagmay nga mga tipik mas mubo kaysa target nga han-ay, apan adunay piho nga homology.Mahimo silang madugtong sa usag usa, ug pagkahuman mahimong komplementaryo sa mga primer, ang mga produkto sa PCR mahimong mapadako, nga moresulta sa mga sayup nga positibo, nga mahimo’g mapakunhod o mawagtang pinaagi sa mga nested PCR nga pamaagi.
3.Non-specific amplification bands makita Ang mga bands nga makita human sa PCR amplification dili uyon sa gipaabot nga gidak-on, mas dako man o mas gamay, o ang duha ka piho nga amplification bands ug non-specific amplification bands makita sa samang higayon.Ang mga hinungdan sa pagpakita sa dili piho nga mga banda mao ang: una, ang mga primera dili hingpit nga komplemento sa target nga han-ay, o ang mga primer nag-ipon aron mahimong mga dimer.Ang ikaduha nga rason mao nga ang Mg2+ ion konsentrasyon mao ang taas kaayo, ang annealing temperatura mao ang ubos kaayo, ug ang gidaghanon sa PCR cycle mao ang taas kaayo.Ang ikaduha nga hinungdan mao ang kalidad ug gidaghanon sa enzyme.Ang mga enzyme gikan sa pipila ka mga tinubdan kanunay nga dali nga adunay dili piho nga mga banda apan ang mga enzyme gikan sa ubang mga gigikanan dili.Ang sobra nga gidaghanon sa mga enzyme usahay mosangpot sa dili piho nga pagpadako.Ang mga kontra nga lakang naglakip sa: pagdesinyo pag-usab sa mga primer kung gikinahanglan.Bawasan ang gidaghanon sa enzyme o pulihan kini og laing tinubdan.Bawasan ang gidaghanon sa mga primer, dugangi ang gidaghanon sa template sa hustong paagi, ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga siklo.Dugangi ang temperatura sa annealing sa hustong paagi o gamita ang duha ka temperatura nga paagi sa punto (denaturasyon sa 93°C, annealing ug extension sa palibot sa 65°C).
4.Flaky drag o smears makita PCR amplification usahay makita ingon smeared bands, sheet-like bands o carpet-like bands.Ang mga hinungdan kasagaran tungod sa sobra nga enzyme o dili maayo nga kalidad sa enzyme, taas kaayo nga konsentrasyon sa dNTP, taas kaayo nga konsentrasyon sa Mg2+, ubos kaayo nga temperatura sa annealing, ug daghan kaayong mga siklo.Ang mga kontra nga lakang naglakip sa: ① Bawasan ang gidaghanon sa enzyme, o ilisan ang enzyme og laing tinubdan.②Pakunhod ang konsentrasyon sa dNTP.Tukma nga pagkunhod sa konsentrasyon sa Mg2+.Dugangi ang gidaghanon sa mga templates ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga cycle