PCR FAQ 1. Negyddol ffug, nid oes unrhyw fand ymhelaethu yn ymddangos 2. Cadarnhaol ffug 3. Mae bandiau mwyhau amhenodol yn ymddangos 4. Stribedi llusgo fflac neu stribedi ceg y groth yn ymddangos:
1 Negyddol ffug, dim band chwyddedig yn ymddangos Agweddau allweddol yr adwaith PCR yw
① paratoi asid niwclëig templed
② ansawdd primer a phenodoldeb
③ ansawdd ensym a
④ amodau beicio PCR.I ddod o hyd i'r rhesymau, dylid cynnal dadansoddiad ac ymchwil hefyd ar y dolenni uchod.
Templed:
① Mae'r templed yn cynnwys proteinau amhuredd
② Mae'r templed yn cynnwys atalyddion ensymau Taq
③ Nid yw'r proteinau yn y templed yn cael eu treulio a'u tynnu, yn enwedig yr histones mewn cromosomau
④ Collwyd gormod yn ystod echdynnu a pharatoi'r templed, neu anadlwyd ffenol
⑤ Nid yw'r templed asid niwclëig wedi'i ddadnatureiddio'n llwyr.Pan fo ansawdd ensymau a phremwyr yn dda, os nad yw bandiau ymhelaethu yn ymddangos, mae'n fwyaf tebygol bod rhywbeth o'i le ar broses dreulio'r sbesimen neu'r templed proses echdynnu asid niwclëig.Felly, rhaid paratoi datrysiad treulio effeithiol a sefydlog, a dylai'r weithdrefn fod yn sefydlog ac ni ddylid ei newid yn ôl ewyllys..Anactifadu ensymau: Mae angen amnewid yr ensym newydd, neu ddefnyddio ensymau hen a newydd ar yr un pryd i ddadansoddi a yw negatifau ffug yn cael eu hachosi gan golled neu weithgaredd ensymau annigonol.Dylid nodi bod weithiau mae'r ensym Taq yn angof.Primers: Primer ansawdd, crynodiad primer, ac a yw'r crynodiadau o'r ddau primers yn gymesur yn rhesymau cyffredin dros fethiant PCR neu fandiau ymhelaethu anfoddhaol a trylediad hawdd.Ceir problemau gydag ansawdd synthesis paent preimio mewn rhai sypiau.Mae gan un o'r ddau primer grynodiad uchel ac mae gan y llall grynodiad isel, gan arwain at ymhelaethiad anghymesur effeithlonrwydd isel.
Y gwrth-fesurau yw:
① Dewiswch uned synthesis paent preimio da.
② Dylai crynodiad y paent preimio nid yn unig edrych ar y gwerth OD, ond hefyd roi sylw i'r datrysiad stoc preimio ar gyfer electrofforesis gel agarose.Rhaid cael bandiau preimio, a dylai disgleirdeb y ddau fand preimio fod yn fras yr un peth.Er enghraifft, mae gan un paent preimio fand ac nid oes gan y preimiwr arall unrhyw fand.Ar gyfer stribedi, efallai y bydd PCR yn methu ar hyn o bryd a dylid ei ddatrys trwy drafod gyda'r uned synthesis paent preimio.Os oes gan un paent preimio ddisgleirdeb uchel a disgleirdeb isel yn y llall, cydbwyswch y crynodiadau wrth wanhau'r paent preimio.
③ Dylid storio preimio mewn crynodiad uchel a symiau bach i atal rhewi a dadmer dro ar ôl tro neu storio hirdymor yn yr oergell, a all arwain at ddirywiad a diraddio'r paent preimio.
④ Mae'r dyluniad paent preimio yn afresymol, fel nad yw hyd y paent preimio yn ddigon, mae dimers yn cael eu ffurfio rhwng paent preimio, ac ati. Crynodiad Mg2+: Mae crynodiad ïon Mg2+ yn ddylanwad mawr ar effeithlonrwydd ymhelaethu PCR.Os yw'r crynodiad yn rhy uchel, gall leihau penodolrwydd ymhelaethiad PCR.Os yw'r crynodiad yn rhy isel, bydd yn effeithio ar gynnyrch ymhelaethu PCR a hyd yn oed yn achosi i'r ymhelaethiad PCR fethu heb ymhelaethu ar fandiau.Newidiadau mewn cyfaint adwaith: Fel arfer y cyfeintiau a ddefnyddir ar gyfer ymhelaethu PCR yw 20ul, 30ul, a 50ul.Neu 100ul, pa gyfaint y dylid ei ddefnyddio ar gyfer ymhelaethu PCR wedi'i osod yn unol â gwahanol ddibenion ymchwil wyddonol a phrofion clinigol.Ar ôl gwneud cyfaint fach, fel 20ul, ac yna gwneud cyfaint mwy, rhaid i chi ddilyn yr amodau, fel arall bydd yn hawdd methu.Rhesymau ffisegol: Mae dadnatureiddio yn bwysig iawn ar gyfer ymhelaethu ar PCR.Os yw'r tymheredd dadnatureiddio yn isel a'r amser dadnatureiddio yn fyr, mae'n debygol iawn y bydd negatifau ffug yn digwydd;mae'r tymheredd anelio yn rhy isel, a all achosi mwyhad nad yw'n benodol a lleihau'r effeithlonrwydd ymhelaethu penodol.Mae'r tymheredd anelio yn rhy uchel.Yn effeithio'n fawr ar rwymo paent preimio i dempledi ac yn lleihau effeithlonrwydd mwyhau PCR.Weithiau mae angen defnyddio thermomedr safonol i wirio'r tymereddau dadnatureiddio, anelio ac ymestyn yn y mwyhadur neu'r pot sy'n hydoddi mewn dŵr.Mae hyn hefyd yn un o'r rhesymau dros fethiant PCR.Amrywiad dilyniant targed: Os yw'r dilyniant targed yn cael ei dreiglo neu ei ddileu, sy'n effeithio ar rwymo penodol y paent preimio i'r templed, neu mae'r paent preimio a'r templed yn colli'r dilyniant cyflenwol oherwydd dileu segment penodol o'r dilyniant targed, ymhelaethiad PCR ni fydd yn llwyddiannus.
2.false positif Mae'r band ymhelaethu PCR sy'n ymddangos yn gyson â'r band dilyniant targed, ac weithiau mae'r band yn fwy trefnus a mwy disglair.Dyluniad primer amhriodol: Mae gan y dilyniant ymhelaethu a ddewiswyd homoleg gyda'r dilyniant ymhelaethu nad yw'n darged, felly wrth berfformio ymhelaethu PCR, mae'r cynnyrch PCR chwyddedig yn ddilyniant nad yw'n darged.Os yw'r dilyniant targed yn rhy fyr neu os yw'r paent preimio yn rhy fyr, gall canlyniadau positif ffug ddigwydd yn hawdd.Mae angen ailgynllunio preimio.Croeshalogi dilyniannau targed neu gynhyrchion ymhelaethu: Mae dau reswm dros yr halogiad hwn: Yn gyntaf, croeshalogi'r genom cyfan neu ddarnau mawr, gan arwain at bethau positif ffug.Gellir datrys y positif ffug hwn trwy'r dulliau canlynol: Byddwch yn ofalus ac yn ysgafn wrth weithredu i atal y dilyniant targed rhag cael ei sugno i'r gwn sampl neu ei dasgu allan o'r tiwb centrifuge.Ac eithrio ensymau a sylweddau na allant wrthsefyll tymheredd uchel, dylai pob adweithydd neu offer gael eu sterileiddio gan bwysedd uchel.Dylid defnyddio pob tiwb centrifuge ac awgrymiadau pibed pigiad sampl unwaith.Os oes angen, mae'r tiwbiau adwaith a'r adweithyddion yn cael eu harbelydru â golau uwchfioled cyn ychwanegu'r sbesimen i ddinistrio'r asidau niwclëig sy'n bresennol.Yr ail yw halogi darnau bach o asidau niwclëig yn yr aer.Mae'r darnau bach hyn yn fyrrach na'r dilyniant targed, ond mae ganddynt homoleg benodol.Gellir eu sbleisio i'w gilydd, ac ar ôl bod yn gyflenwol i'r paent preimio, gellir ymhelaethu ar y cynhyrchion PCR, gan arwain at bethau positif ffug, y gellir eu lleihau neu eu dileu trwy ddulliau PCR nythu.
Bandiau ymhelaethu 3.Non-benodol yn ymddangos Mae'r bandiau sy'n ymddangos ar ôl ymhelaethu PCR yn anghyson â'r maint disgwyliedig, naill ai'n fwy neu'n llai, neu mae'r ddau fand ymhelaethu penodol a bandiau ymhelaethu amhenodol yn ymddangos ar yr un pryd.Y rhesymau dros ymddangosiad bandiau amhenodol yw: yn gyntaf, nid yw'r paent preimio yn gwbl ategu'r dilyniant targed, neu mae'r paent preimio yn agregu i ffurfio dimers.Yr ail reswm yw bod crynodiad ïon Mg2 + yn rhy uchel, mae'r tymheredd anelio yn rhy isel, ac mae nifer y cylchoedd PCR yn rhy uchel.Yr ail ffactor yw ansawdd a maint yr ensym.Mae ensymau o rai ffynonellau yn aml yn dueddol o gael bandiau amhenodol ond nid yw ensymau o ffynonellau eraill yn gwneud hynny.Gall symiau gormodol o ensymau weithiau arwain at ymhelaethu amhenodol.Mae'r gwrthfesurau'n cynnwys: ailgynllunio paent preimio os oes angen.Lleihau faint o ensym neu roi ffynhonnell arall yn ei le.Lleihau faint o preimio, cynyddu faint o dempled yn briodol, a lleihau nifer y cylchoedd.Cynyddwch y tymheredd anelio yn briodol neu defnyddiwch y dull pwynt dau dymheredd (dadnatureiddio ar 93 ° C, anelio ac ymestyn tua 65 ° C).
4. Llusgwch fflawiog neu taeniad yn ymddangos Mae ymhelaethiad PCR weithiau'n ymddangos fel bandiau taeniad, bandiau tebyg i ddalen neu fandiau tebyg i garped.Mae'r rhesymau'n aml yn cael eu hachosi gan ormod o ensym neu ansawdd gwael ensym, crynodiad dNTP rhy uchel, crynodiad Mg2+ rhy uchel, tymheredd anelio rhy isel, a gormod o gylchoedd.Mae'r gwrthfesurau'n cynnwys: ① Lleihau faint o ensym, neu amnewid yr ensym â ffynhonnell arall.② Lleihau crynodiad dNTP.Lleihau'r crynodiad Mg2+ yn briodol.Cynyddu nifer y templedi a lleihau nifer y cylchoedd