FAQ PCR 1. Faux négatif, aucune bande d'amplification n'apparaît 2. Faux positif 3. Des bandes d'amplification non spécifiques apparaissent 4. Des bandes de traînée feuilletées ou des bandes de frottis apparaissent :
1Faux négatif, aucune bande amplifiée n'apparaît. Les aspects clés de la réaction PCR sont
① préparation de l'acide nucléique modèle
② Qualité et spécificité de l'amorce
③ qualité des enzymes et
④ Conditions du cycle PCR.Pour trouver les raisons, des analyses et des recherches doivent également être menées sur les liens ci-dessus.
Modèle:
① Le modèle contient des protéines d'impuretés
② Le modèle contient des inhibiteurs de l'enzyme Taq
③ Les protéines de la matrice ne sont ni digérées ni éliminées, en particulier les histones des chromosomes
④ Trop de perte a été perdue lors de l'extraction et de la préparation du modèle, ou du phénol a été inhalé
⑤L'acide nucléique matrice n'est pas complètement dénaturé.Lorsque la qualité des enzymes et des amorces est bonne, si les bandes d’amplification n’apparaissent pas, il est fort probable qu’il y ait un problème avec le processus de digestion de l’échantillon ou le processus d’extraction de l’acide nucléique matrice.Par conséquent, une solution de digestion efficace et stable doit être préparée, et la procédure doit être fixée et ne doit pas être modifiée à volonté..Inactivation de l'enzyme : il est nécessaire de remplacer la nouvelle enzyme ou d'utiliser simultanément des enzymes anciennes et nouvelles pour analyser si les faux négatifs sont causés par une perte ou une activité enzymatique insuffisante.Il convient de noter que parfois l'enzyme Taq est oubliée. Amorces : La qualité des amorces, la concentration des amorces et la symétrie des concentrations des deux amorces sont des raisons courantes d'échec de la PCR ou de bandes d'amplification insatisfaisantes et de diffusion facile.Il existe des problèmes avec la qualité de la synthèse des amorces dans certains lots.L’une des deux amorces a une concentration élevée et l’autre une faible concentration, ce qui entraîne une amplification asymétrique de faible efficacité.
Les contre-mesures sont les suivantes :
① Sélectionnez une bonne unité de synthèse d'amorce.
② La concentration des amorces ne doit pas seulement tenir compte de la valeur OD, mais également de la solution mère d'amorce pour l'électrophorèse sur gel d'agarose.Il doit y avoir des bandes d'amorce et la luminosité des deux bandes d'amorce doit être à peu près la même.Par exemple, une amorce a une bande et l’autre n’a pas de bande.Pour les bandelettes, la PCR peut échouer à ce stade et doit être résolue par négociation avec l'unité de synthèse d'amorces.Si une amorce a une luminosité élevée et l’autre une faible luminosité, équilibrez les concentrations lors de la dilution des amorces.
③ Les apprêts doivent être conservés en concentration élevée et en petites quantités pour éviter des congélations et décongélations répétées ou un stockage à long terme au réfrigérateur, ce qui peut entraîner une détérioration et une dégradation des apprêts.
④La conception de l'amorce est déraisonnable, par exemple la longueur de l'amorce n'est pas suffisante, des dimères se forment entre les amorces, etc. Concentration en Mg2+ : la concentration en ions Mg2+ a une grande influence sur l'efficacité de l'amplification PCR.Si la concentration est trop élevée, cela peut réduire la spécificité de l’amplification PCR.Si la concentration est trop faible, cela affectera le rendement de l’amplification PCR et entraînera même l’échec de l’amplification PCR sans bandes amplifiées.Modifications du volume de réaction : Habituellement, les volumes utilisés pour l'amplification PCR sont de 20 ul, 30 ul et 50 ul.Ou 100 ul, le volume à utiliser pour l'amplification PCR est défini en fonction des différents objectifs de la recherche scientifique et des tests cliniques.Après avoir créé un petit volume, comme 20 ul, puis créé un volume plus grand, vous devez suivre les conditions, sinon cela échouera facilement.Raisons physiques : La dénaturation est très importante pour l’amplification PCR.Si la température de dénaturation est basse et le temps de dénaturation court, des faux négatifs sont très susceptibles de se produire ;la température de recuit est trop basse, ce qui peut provoquer une amplification non spécifique et réduire l'efficacité de l'amplification spécifique.La température de recuit est trop élevée.Affecte fortement la liaison des amorces aux matrices et réduit l'efficacité de l'amplification PCR.Il est parfois nécessaire d'utiliser un thermomètre étalon pour vérifier les températures de dénaturation, de recuit et d'extension dans l'amplificateur ou le pot soluble dans l'eau.C’est aussi l’une des raisons de l’échec du PCR.Variation de la séquence cible : si la séquence cible est mutée ou supprimée, ce qui affecte la liaison spécifique de l'amorce à la matrice, ou si l'amorce et la matrice perdent la séquence complémentaire en raison de la suppression d'un certain segment de la séquence cible, l'amplification PCR ne réussira pas.
2.faux positif La bande d'amplification PCR qui apparaît est cohérente avec la bande de séquence cible, et parfois la bande est plus ordonnée et plus lumineuse.Conception d'amorce inappropriée : la séquence d'amplification sélectionnée présente une homologie avec la séquence d'amplification non cible, de sorte que lors de l'amplification PCR, le produit PCR amplifié est une séquence non cible.Si la séquence cible ou l’amorce est trop courte, des faux positifs peuvent facilement se produire.Les amorces doivent être repensées.Contamination croisée de séquences cibles ou de produits d'amplification : Il y a deux raisons à cette contamination : Premièrement, une contamination croisée de l'ensemble du génome ou de gros fragments, conduisant à des faux positifs.Ce faux positif peut être résolu par les méthodes suivantes : Soyez prudent et doux lors de l'opération pour éviter que la séquence cible ne soit aspirée dans le pistolet à échantillon ou projetée hors du tube à centrifuger.À l'exception des enzymes et des substances qui ne résistent pas aux températures élevées, tous les réactifs ou équipements doivent être stérilisés à haute pression.Tous les tubes à centrifuger et les embouts de pipettes d’injection d’échantillon doivent être utilisés une seule fois.Si nécessaire, les tubes de réaction et les réactifs sont irradiés avec de la lumière ultraviolette avant d'ajouter l'échantillon pour détruire les acides nucléiques présents.La seconde est la contamination de petits fragments d’acides nucléiques présents dans l’air.Ces petits fragments sont plus courts que la séquence cible, mais présentent une certaine homologie.Ils peuvent être épissés les uns aux autres et, après avoir été complémentaires des amorces, les produits de PCR peuvent être amplifiés, ce qui entraîne des faux positifs, qui peuvent être réduits ou éliminés par des méthodes de PCR imbriquées.
3. Des bandes d'amplification non spécifiques apparaissent. Les bandes qui apparaissent après l'amplification PCR ne correspondent pas à la taille attendue, soit plus grandes ou plus petites, ou des bandes d'amplification spécifiques et des bandes d'amplification non spécifiques apparaissent en même temps.Les raisons de l'apparition de bandes non spécifiques sont les suivantes : premièrement, les amorces ne sont pas complètement complémentaires de la séquence cible, ou les amorces s'agrègent pour former des dimères.La deuxième raison est que la concentration en ions Mg2+ est trop élevée, la température d’hybridation est trop basse et le nombre de cycles PCR est trop élevé.Le deuxième facteur est la qualité et la quantité de l’enzyme.Les enzymes provenant de certaines sources sont souvent sujettes à des bandes non spécifiques, mais pas les enzymes provenant d'autres sources.Des quantités excessives d’enzymes peuvent parfois conduire à une amplification non spécifique.Les contre-mesures comprennent : reconcevoir les amorces si nécessaire.Réduisez la quantité d’enzyme ou remplacez-la par une autre source.Réduisez la quantité d’amorces, augmentez la quantité de modèle de manière appropriée et réduisez le nombre de cycles.Augmentez la température de recuit de manière appropriée ou utilisez la méthode des deux points de température (dénaturation à 93°C, recuit et extension autour de 65°C).
4. Des traînées ou des frottis feuilletés apparaissent. L'amplification PCR apparaît parfois sous la forme de bandes étalées, de bandes en forme de feuille ou de bandes en forme de tapis.Les raisons sont souvent causées par une trop grande quantité d'enzymes ou une mauvaise qualité d'enzyme, une concentration trop élevée de dNTP, une concentration trop élevée de Mg2+, une température d'hybridation trop basse et un trop grand nombre de cycles.Les contre-mesures comprennent : ① Réduire la quantité d'enzyme ou remplacer l'enzyme par une autre source.②Réduire la concentration de dNTP.Réduire de manière appropriée la concentration de Mg2+.Augmentez le nombre de modèles et réduisez le nombre de cycles