Preguntas frecuentes sobre PCR 1. Falso negativo, non aparece banda de amplificación 2. Falso positivo 3. Aparecen bandas de amplificación inespecíficas 4. Aparecen tiras de arrastre escamosas ou tiras de frotis:
1Falso negativo, non aparece ningunha banda amplificada Os aspectos clave da reacción da PCR son
① preparación de ácido nucleico modelo
② calidade de imprimación e especificidade
③ calidade dos encimas e
④ Condicións do ciclo de PCR.Para atopar os motivos, tamén se deben realizar análises e investigacións nas ligazóns anteriores.
Modelo:
① O modelo contén proteínas impurezas
② O modelo contén inhibidores da encima Taq
③ As proteínas do molde non son dixeridas nin eliminadas, especialmente as histonas dos cromosomas
④ Perdeuse demasiado durante a extracción e preparación do molde, ou inhalouse fenol
⑤O ácido nucleico modelo non está completamente desnaturalizado.Cando a calidade das encimas e dos cebadores é boa, se non aparecen bandas de amplificación, o máis probable é que haxa algo mal no proceso de dixestión da mostra ou no proceso de extracción do ácido nucleico do molde.Polo tanto, debe prepararse unha solución de dixestión eficaz e estable, e o procedemento debe ser fixado e non se debe cambiar a vontade..Inactivación enzimática: é necesario substituír a nova encima, ou utilizar tanto encimas antigas como novas ao mesmo tempo para analizar se os falsos negativos son causados pola perda ou unha actividade enzimática insuficiente.Cómpre ter en conta que ás veces se esquece o encima Taq. Cebadores: a calidade do cebador, a concentración do cebador e se as concentracións dos dous cebadores son simétricas son razóns habituais de falla da PCR ou bandas de amplificación insatisfactorias e fácil difusión.Hai problemas coa calidade da síntese de cebadores nalgúns lotes.Un dos dous cebadores ten unha concentración elevada e o outro ten unha concentración baixa, o que resulta nunha amplificación asimétrica de baixa eficiencia.
As contramedidas son:
① Seleccione unha boa unidade de síntese de cebadores.
② A concentración de cebadores non só debe mirar o valor OD, senón tamén prestar atención á solución stock de cebadores para a electroforese en xel de agarosa.Debe haber bandas de imprimación e o brillo das dúas bandas de imprimación debe ser aproximadamente o mesmo.Por exemplo, un cebador ten unha banda e o outro cebador non ten banda.Para as tiras, a PCR pode fallar neste momento e debe resolverse mediante a negociación coa unidade de síntese de cebadores.Se un imprimador ten un brillo alto e o outro ten un brillo baixo, equilibre as concentracións ao diluír os imprimadores.
③ Os imprimadores deben almacenarse en alta concentración e pequenas cantidades para evitar a conxelación e desconxelación repetidas ou o almacenamento a longo prazo na neveira, o que pode provocar o deterioro e degradación dos imprimadores.
④O deseño do cebador non é razoable, xa que a lonxitude do cebador non é suficiente, fórmanse dímeros entre os cebadores, etc. Concentración de Mg2+: a concentración de ións Mg2+ ten unha gran influencia na eficiencia da amplificación da PCR.Se a concentración é demasiado alta, pode reducir a especificidade da amplificación por PCR.Se a concentración é demasiado baixa, afectará o rendemento da amplificación da PCR e incluso provocará que a amplificación da PCR falle sen amplificar as bandas.Cambios no volume de reacción: normalmente os volumes utilizados para a amplificación da PCR son 20ul, 30ul e 50ul.Ou 100ul, o volume que se debe usar para a amplificación da PCR establécese segundo os diferentes propósitos de investigación científica e probas clínicas.Despois de facer un volume pequeno, como 20 ul, e despois facer un volume maior, debes seguir as condicións, se non, fallará facilmente.Razóns físicas: a desnaturalización é moi importante para a amplificación por PCR.Se a temperatura de desnaturalización é baixa e o tempo de desnaturalización é curto, é moi probable que se produzan falsos negativos;a temperatura de recocido é demasiado baixa, o que pode provocar unha amplificación inespecífica e reducir a eficiencia da amplificación específica.A temperatura de recocido é demasiado alta.Afecta moito á unión dos cebadores aos modelos e reduce a eficiencia da amplificación da PCR.Ás veces é necesario utilizar un termómetro estándar para comprobar as temperaturas de desnaturalización, recocido e extensión no amplificador ou o pote soluble en auga.Esta é tamén unha das razóns do fracaso da PCR.Variación da secuencia diana: se a secuencia diana está mutada ou eliminada, o que afecta á unión específica do cebador ao molde, ou o cebador e o molde perden a secuencia complementaria debido á deleción dun determinado segmento da secuencia diana, a amplificación por PCR. non terá éxito.
2.falso positivo A banda de amplificación da PCR que aparece é consistente coa banda da secuencia diana, e ás veces a banda é máis ordenada e brillante.Deseño de cebador inadecuado: a secuencia de amplificación seleccionada ten homoloxía coa secuencia de amplificación non diana, polo que cando se realiza a amplificación da PCR, o produto da PCR amplificada é unha secuencia non diana.Se a secuencia diana é demasiado curta ou o cebador é demasiado curto, pódense producir facilmente falsos positivos.Os imprimadores deben ser redeseñados.Contaminación cruzada de secuencias diana ou produtos de amplificación: hai dúas razóns para esta contaminación: En primeiro lugar, a contaminación cruzada de todo o xenoma ou de fragmentos grandes, que orixinan falsos positivos.Este falso positivo pódese resolver mediante os seguintes métodos: Teña coidado e coidado ao operar para evitar que a secuencia obxectivo sexa succionada pola pistola de mostra ou salpicada fóra do tubo da centrífuga.Salvo encimas e substancias que non poden soportar altas temperaturas, todos os reactivos ou equipos deben esterilizarse a alta presión.Todos os tubos de centrífuga e as puntas das pipetas de inxección de mostras deben usarse unha vez.Se é necesario, os tubos de reacción e os reactivos irradianse con luz ultravioleta antes de engadir a mostra para destruír os ácidos nucleicos presentes.A segunda é a contaminación de pequenos fragmentos de ácidos nucleicos no aire.Estes pequenos fragmentos son máis curtos que a secuencia diana, pero teñen certa homoloxía.Pódense empalmar entre si, e despois de ser complementarios dos cebadores, os produtos da PCR pódense amplificar, dando como resultado falsos positivos, que poden reducirse ou eliminarse mediante métodos de PCR aniñadas.
3.Aparecen bandas de amplificación inespecíficas As bandas que aparecen despois da amplificación por PCR son inconsistentes co tamaño esperado, xa sexa maior ou menor, ou aparecen ao mesmo tempo bandas de amplificación específicas e bandas de amplificación non específicas.Os motivos da aparición de bandas inespecíficas son: primeiro, os cebadores non son completamente complementarios da secuencia diana, ou os cebadores se agregan para formar dímeros.A segunda razón é que a concentración de ións Mg2+ é demasiado alta, a temperatura de recocido é demasiado baixa e o número de ciclos de PCR é demasiado alto.O segundo factor é a calidade e cantidade da enzima.Os encimas dalgunhas fontes adoitan ser propensos a formar bandas non específicas, pero os encimas doutras fontes non.As cantidades excesivas de encimas ás veces poden levar a unha amplificación inespecífica.As contramedidas inclúen: redeseñar imprimacións se é necesario.Reducir a cantidade de encima ou substituílo por outra fonte.Reducir a cantidade de cebadores, aumentar a cantidade de plantilla adecuadamente e reducir o número de ciclos.Aumente a temperatura de recocido adecuadamente ou use o método de dous puntos de temperatura (desnaturalización a 93 °C, recocido e extensión ao redor de 65 °C).
4.Faky arrastre ou manchas aparecen amplificación por PCR ás veces aparece como bandas manchadas, bandas tipo láminas ou bandas tipo alfombra.As razóns adoitan ser causadas por demasiada encima ou a mala calidade do encima, unha concentración de dNTP demasiado alta, unha concentración de Mg2+ demasiado alta, unha temperatura de recocido demasiado baixa e demasiados ciclos.As contramedidas inclúen: ① Reducir a cantidade de encima ou substituír a encima por outra fonte.②Reducir a concentración de dNTP.Reducir adecuadamente a concentración de Mg2+.Aumenta a cantidade de modelos e reduce o número de ciclos