PCR FAQ 1. ફોલ્સ નેગેટિવ, કોઈ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ દેખાતું નથી 2. ફોલ્સ પોઝિટિવ 3. નોન-સ્પેસિફિક એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ્સ દેખાય છે 4. ફ્લેકી ડ્રેગ સ્ટ્રીપ્સ અથવા સ્મીયર સ્ટ્રીપ્સ દેખાય છે：

1ખોટી નકારાત્મક, કોઈ એમ્પ્લીફાઈડ બેન્ડ દેખાતું નથી પીસીઆર પ્રતિક્રિયાના મુખ્ય પાસાઓ છે

① નમૂના ન્યુક્લીક એસિડની તૈયારી

② પ્રાઈમર ગુણવત્તા અને વિશિષ્ટતા

③ એન્ઝાઇમ ગુણવત્તા અને

④ PCR ચક્ર શરતો.કારણો શોધવા માટે, ઉપરોક્ત લિંક્સ પર વિશ્લેષણ અને સંશોધન પણ હાથ ધરવા જોઈએ.

ઢાંચો:

① નમૂનામાં અશુદ્ધ પ્રોટીન હોય છે

② નમૂનામાં Taq એન્ઝાઇમ અવરોધકો છે

③ ટેમ્પલેટમાં પ્રોટીન પચવામાં આવતા નથી અને દૂર કરવામાં આવતા નથી, ખાસ કરીને રંગસૂત્રોમાંના હિસ્ટોન્સ

④ નમૂનાના નિષ્કર્ષણ અને તૈયારી દરમિયાન ઘણું બધું ખોવાઈ ગયું હતું અથવા ફિનોલ શ્વાસમાં લેવામાં આવ્યું હતું

⑤ ટેમ્પલેટ ન્યુક્લીક એસિડ સંપૂર્ણપણે વિકૃત નથી.જ્યારે ઉત્સેચકો અને પ્રાઈમર્સની ગુણવત્તા સારી હોય છે, જો એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ્સ દેખાતા નથી, તો સંભવ છે કે નમૂનાની પાચન પ્રક્રિયા અથવા ટેમ્પલેટ ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયામાં કંઈક ખોટું છે.તેથી, અસરકારક અને સ્થિર પાચન સોલ્યુશન તૈયાર કરવું આવશ્યક છે, અને પ્રક્રિયા નિશ્ચિત હોવી જોઈએ અને ઇચ્છા મુજબ બદલવી જોઈએ નહીં..એન્ઝાઇમ નિષ્ક્રિયતા: નવા એન્ઝાઇમને બદલવું જરૂરી છે અથવા એક જ સમયે જૂના અને નવા બંને એન્ઝાઇમનો ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે કે શું ખોટા નકારાત્મક નુકસાન અથવા એન્ઝાઇમની અપૂરતી પ્રવૃત્તિને કારણે છે.એ નોંધવું જોઈએ કે કેટલીકવાર Taq એન્ઝાઇમ ભૂલી જવામાં આવે છે. પ્રાઈમર: પ્રાઈમર ગુણવત્તા, પ્રાઈમર સાંદ્રતા અને બે પ્રાઈમરની સાંદ્રતા સપ્રમાણ છે કે કેમ તે PCR નિષ્ફળતા અથવા અસંતોષકારક એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ્સ અને સરળ પ્રસરણ માટેના સામાન્ય કારણો છે.કેટલાક બૅચેસમાં પ્રાઇમર સિન્થેસિસની ગુણવત્તા સાથે સમસ્યાઓ છે.બે પ્રાઈમરોમાંના એકમાં ઊંચી સાંદ્રતા હોય છે અને બીજામાં ઓછી સાંદ્રતા હોય છે, જેના પરિણામે ઓછી કાર્યક્ષમતા અસમપ્રમાણ એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે.

પ્રતિકારક પગલાં છે:

① સારી પ્રાઈમર સિન્થેસિસ યુનિટ પસંદ કરો.

② પ્રાઇમર્સની સાંદ્રતાએ માત્ર OD મૂલ્યને જ જોવું જોઈએ નહીં, પણ એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ માટે પ્રાઈમર સ્ટોક સોલ્યુશન પર પણ ધ્યાન આપવું જોઈએ.પ્રાઈમર બેન્ડ્સ હોવા જોઈએ અને બે પ્રાઈમર બેન્ડની બ્રાઈટનેસ લગભગ સમાન હોવી જોઈએ.ઉદાહરણ તરીકે, એક પ્રાઈમરમાં બેન્ડ છે અને બીજા પ્રાઈમરમાં કોઈ બેન્ડ નથી.સ્ટ્રીપ્સ માટે, PCR આ સમયે નિષ્ફળ થઈ શકે છે અને પ્રાઈમર સિન્થેસિસ યુનિટ સાથે વાટાઘાટો દ્વારા ઉકેલી શકાય છે.જો એક પ્રાઈમરમાં વધુ તેજ હોય ​​અને બીજામાં ઓછી તેજ હોય, તો પ્રાઈમરને પાતળું કરતી વખતે સાંદ્રતાને સંતુલિત કરો.

③ રેફ્રિજરેટરમાં વારંવાર થીજવું અને પીગળવું અથવા લાંબા ગાળાના સંગ્રહને રોકવા માટે પ્રાઈમર્સને ઉચ્ચ સાંદ્રતા અને ઓછી માત્રામાં સંગ્રહિત કરવા જોઈએ, જે પ્રાઈમરના બગાડ અને અધોગતિ તરફ દોરી શકે છે.

④પ્રાઈમર ડિઝાઇન ગેરવાજબી છે, જેમ કે પ્રાઈમરની લંબાઈ પૂરતી નથી, પ્રાઈમર વગેરે વચ્ચે ડાઇમર્સ રચાય છે. Mg2+ સાંદ્રતા: Mg2+ આયન સાંદ્રતા PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પર મોટો પ્રભાવ ધરાવે છે.જો સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી હોય, તો તે PCR એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતાને ઘટાડી શકે છે.જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો તે PCR એમ્પ્લીફિકેશન યીલ્ડને અસર કરશે અને PCR એમ્પ્લીફિકેશનને એમ્પ્લીફાઈંગ બેન્ડ વિના નિષ્ફળ થવાનું કારણ પણ બનશે.પ્રતિક્રિયાના જથ્થામાં ફેરફાર: સામાન્ય રીતે PCR એમ્પ્લીફિકેશન માટે વપરાતા વોલ્યુમો 20ul, 30ul અને 50ul છે.અથવા 100ul, PCR એમ્પ્લીફિકેશન માટે કયા વોલ્યુમનો ઉપયોગ કરવો જોઈએ તે વૈજ્ઞાનિક સંશોધન અને ક્લિનિકલ પરીક્ષણના વિવિધ હેતુઓ અનુસાર સેટ કરવામાં આવે છે.નાનું વોલ્યુમ બનાવ્યા પછી, જેમ કે 20ul, અને પછી મોટું વોલ્યુમ બનાવવું, તમારે શરતોનું પાલન કરવું આવશ્યક છે, અન્યથા તે સરળતાથી નિષ્ફળ જશે.શારીરિક કારણો: પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે વિકૃતિકરણ ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.જો વિકૃતિકરણ તાપમાન ઓછું હોય અને વિકૃતિકરણનો સમય ઓછો હોય, તો ખોટા નકારાત્મક થવાની સંભાવના છે;એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઓછું છે, જે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું કારણ બની શકે છે અને ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને ઘટાડી શકે છે.એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઊંચું છે.ટેમ્પલેટ્સમાં પ્રાઇમર્સના બંધનને ખૂબ અસર કરે છે અને PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને ઘટાડે છે.કેટલીકવાર એમ્પ્લીફાયર અથવા પાણીમાં દ્રાવ્ય પોટમાં વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન તાપમાન ચકાસવા માટે પ્રમાણભૂત થર્મોમીટરનો ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે.પીસીઆર ફેલ થવાનું આ પણ એક કારણ છે.લક્ષ્ય ક્રમ ભિન્નતા: જો લક્ષ્ય ક્રમ પરિવર્તિત થાય છે અથવા કાઢી નાખવામાં આવે છે, જે નમૂના સાથે પ્રાઇમરના ચોક્કસ બંધનને અસર કરે છે, અથવા પ્રાઇમર અને ટેમ્પ્લેટ લક્ષ્ય ક્રમના ચોક્કસ સેગમેન્ટને કાઢી નાખવાને કારણે પૂરક ક્રમ ગુમાવે છે, તો PCR એમ્પ્લીફિકેશન સફળ થશે નહીં.

2.ખોટા ધનઅયોગ્ય પ્રાઈમર ડિઝાઈન: પસંદ કરેલ એમ્પ્લીફિકેશન સિક્વન્સ બિન-લક્ષ્ય એમ્પ્લીફિકેશન ક્રમ સાથે સમાનતા ધરાવે છે, તેથી PCR એમ્પ્લીફિકેશન કરતી વખતે, એમ્પ્લીફાઈડ PCR ઉત્પાદન એ બિન-લક્ષ્ય ક્રમ છે.જો લક્ષ્ય ક્રમ ખૂબ ટૂંકો હોય અથવા પ્રાઈમર ખૂબ નાનો હોય, તો ખોટા હકારાત્મક સરળતાથી થઈ શકે છે.પ્રાઇમર્સને ફરીથી ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે.લક્ષ્ય ક્રમ અથવા એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોનું ક્રોસ-દૂષણ: આ દૂષણના બે કારણો છે: પ્રથમ, સમગ્ર જીનોમ અથવા મોટા ટુકડાઓનું ક્રોસ-દૂષણ, જે ખોટા હકારાત્મક તરફ દોરી જાય છે.આ ખોટા હકારાત્મકને નીચેની પદ્ધતિઓ દ્વારા ઉકેલી શકાય છે: લક્ષ્ય ક્રમને નમૂના બંદૂકમાં ચૂસવામાં અથવા સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાંથી છંટકાવ થતો અટકાવવા માટે કાર્ય કરતી વખતે સાવચેત અને નમ્રતા રાખો.ઉત્સેચકો અને પદાર્થો સિવાય કે જે ઊંચા તાપમાનનો સામનો કરી શકતા નથી, બધા રીએજન્ટ્સ અથવા સાધનોને ઉચ્ચ દબાણ દ્વારા વંધ્યીકૃત કરવું જોઈએ.તમામ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ અને સેમ્પલ ઈન્જેક્શન પીપેટ ટીપ્સનો એકવાર ઉપયોગ કરવો જોઈએ.જો જરૂરી હોય તો, હાજર ન્યુક્લીક એસિડનો નાશ કરવા માટે નમૂનો ઉમેરતા પહેલા પ્રતિક્રિયા ટ્યુબ અને રીએજન્ટને અલ્ટ્રાવાયોલેટ પ્રકાશથી ઇરેડિયેટ કરવામાં આવે છે.બીજું હવામાં ન્યુક્લીક એસિડના નાના ટુકડાઓનું દૂષણ છે.આ નાના ટુકડાઓ લક્ષ્ય ક્રમ કરતાં ટૂંકા હોય છે, પરંતુ ચોક્કસ હોમોલોજી ધરાવે છે.તેઓ એકબીજા સાથે વિભાજિત કરી શકાય છે, અને પ્રાઇમર્સના પૂરક બન્યા પછી, પીસીઆર ઉત્પાદનોને વિસ્તૃત કરી શકાય છે, પરિણામે ખોટા ધનમાં પરિણમે છે, જે નેસ્ટેડ પીસીઆર પદ્ધતિઓ દ્વારા ઘટાડી અથવા દૂર કરી શકાય છે.

 

3.બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ દેખાય છે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પછી દેખાતા બેન્ડ્સ અપેક્ષિત કદ સાથે અસંગત હોય છે, કાં તો મોટા કે નાના, અથવા ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ અને નોન-સ્પેસિફિક એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ એક જ સમયે દેખાય છે.બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડના દેખાવના કારણો છે: પ્રથમ, પ્રાઇમર્સ લક્ષ્ય ક્રમમાં સંપૂર્ણ રીતે પૂરક નથી, અથવા પ્રાઇમર્સ ડાયમર્સ બનાવવા માટે એકંદરે છે.બીજું કારણ એ છે કે Mg2+ આયનની સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી છે, એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઓછું છે, અને PCR ચક્રની સંખ્યા ખૂબ વધારે છે.બીજું પરિબળ એ એન્ઝાઇમની ગુણવત્તા અને માત્રા છે.કેટલાક સ્ત્રોતોમાંથી ઉત્સેચકો ઘણીવાર બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડ માટે સંવેદનશીલ હોય છે પરંતુ અન્ય સ્ત્રોતોમાંથી ઉત્સેચકો નથી.ઉત્સેચકોની અતિશય માત્રા ક્યારેક બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જાય છે.કાઉન્ટરમેઝર્સનો સમાવેશ થાય છે: જો જરૂરી હોય તો પ્રાઇમર્સને ફરીથી ડિઝાઇન કરો.એન્ઝાઇમની માત્રામાં ઘટાડો અથવા તેને અન્ય સ્ત્રોત સાથે બદલો.પ્રાઇમર્સની માત્રામાં ઘટાડો કરો, યોગ્ય રીતે નમૂનાની માત્રામાં વધારો કરો અને ચક્રની સંખ્યામાં ઘટાડો કરો.એનિલિંગ તાપમાનને યોગ્ય રીતે વધારો અથવા દ્વિ-તાપમાન બિંદુ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો (93°C પર વિકૃતીકરણ, 65°C આસપાસ એનિલિંગ અને વિસ્તરણ).

 

4. ફ્લેકી ડ્રેગ અથવા સ્મીયર્સ દેખાય છે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન ક્યારેક સ્મીર્ડ બેન્ડ, શીટ જેવા બેન્ડ અથવા કાર્પેટ જેવા બેન્ડ તરીકે દેખાય છે.કારણો ઘણીવાર ખૂબ વધારે એન્ઝાઇમ અથવા એન્ઝાઇમની નબળી ગુણવત્તા, ખૂબ ઊંચી dNTP સાંદ્રતા, ખૂબ ઊંચી Mg2+ સાંદ્રતા, ખૂબ નીચું એનિલિંગ તાપમાન અને ઘણા બધા ચક્રને કારણે થાય છે.કાઉન્ટરમેઝર્સમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છે: ① એન્ઝાઇમની માત્રામાં ઘટાડો કરો અથવા એન્ઝાઇમને અન્ય સ્ત્રોત સાથે બદલો.②dNTP ની સાંદ્રતામાં ઘટાડો.Mg2+ સાંદ્રતાને યોગ્ય રીતે ઘટાડે છે.નમૂનાઓની માત્રામાં વધારો અને ચક્રની સંખ્યા ઘટાડવી