FAQ PCR 1. Fo negatif, pa gen okenn gwoup anplifikasyon parèt 2. Fo pozitif 3. Gwoup anplifikasyon ki pa espesifik parèt 4. Bann trennen ekilib oswa bann fwoti parèt:
1Fo negatif, pa gen okenn gwoup anplifye parèt Aspè kle nan reyaksyon PCR la se
① preparasyon modèl asid nikleyik
② bon jan kalite primè ak espesifik
③ bon jan kalite anzim ak
④ kondisyon sik PCR.Pou jwenn rezon ki fè yo, analiz ak rechèch ta dwe tou fèt sou lyen ki anwo yo.
Modèl:
① Modèl la gen pwoteyin enpurte
② Modèl la gen inibitè anzim Taq
③ Pwoteyin yo nan modèl la pa dijere epi retire, espesyalman histones nan kwomozòm.
④ Twòp te pèdi pandan ekstraksyon ak preparasyon modèl la, oswa fenol te respire.
⑤Asid nikleyik modèl la pa konplètman denatire.Lè bon jan kalite a nan anzim ak primè bon, si gwoup anplifikasyon pa parèt, li pi sanble ke gen yon bagay ki mal ak pwosesis dijesyon echantiyon an oswa pwosesis ekstraksyon asid nikleyik modèl la.Se poutèt sa, yo dwe prepare yon solisyon dijesyon efikas ak ki estab, epi pwosedi a ta dwe fiks epi yo pa ta dwe chanje nan volonte..Inactivation anzim: Li nesesè pou ranplase nouvo anzim lan, oswa itilize tou de ansyen ak nouvo anzim an menm tan pou analize si fo negatif yo te koze pa pèt oswa aktivite anzim ensifizan.Li ta dwe remake ke pafwa anzim Taq la bliye.Primers: bon jan kalite primè, konsantrasyon primè, epi si konsantrasyon yo nan de primè yo simetrik se rezon komen pou echèk PCR oswa bann anplifikasyon ki pa satisfezan ak difizyon fasil.Gen pwoblèm ak bon jan kalite a nan sentèz Jadendanfan nan kèk lo.Youn nan de primè yo gen yon gwo konsantrasyon ak lòt la gen yon konsantrasyon ki ba, sa ki lakòz anplifikasyon asimetri ki ba-efikasite.
Kontre mezi yo se:
① Chwazi yon bon inite sentèz Jadendanfan.
② Konsantrasyon primè pa ta dwe sèlman gade valè OD a, men tou, peye atansyon sou solisyon stock Jadendanfan pou elektwoforèz jèl agarose.Fòk gen bann premye, ak klète de gwoup yo ta dwe apeprè menm.Pa egzanp, yon premye gen yon bann ak lòt premye a pa gen yon bann.Pou bann, PCR ka echwe nan moman sa a epi yo ta dwe rezoud atravè negosyasyon ak inite sentèz primè a.Si yon primè gen gwo klète ak lòt la gen yon klète ki ba, balanse konsantrasyon yo lè dilye primè yo.
③ Primè yo ta dwe estoke nan gwo konsantrasyon ak ti kantite pou anpeche konjelasyon repete ak dekonjle oswa depo alontèm nan frijidè a, ki ka mennen nan deteryorasyon ak degradasyon nan primè yo.
④ Konsepsyon primè a pa rezonab, tankou longè Jadendanfan an pa ase, dimè yo fòme ant primè, elatriye Mg2 + konsantrasyon: Mg2 + konsantrasyon ion gen yon gwo enfliyans sou efikasite anplifikasyon PCR.Si konsantrasyon an twò wo, li ka diminye espesifik PCR anplifikasyon.Si konsantrasyon an twò ba, li pral afekte rannman anplifikasyon PCR la e menm lakòz anplifikasyon PCR la echwe san yo pa anplifye gwoup.Chanjman nan volim reyaksyon: Anjeneral volim yo itilize pou anplifikasyon PCR yo se 20ul, 30ul, ak 50ul.Oswa 100ul, ki volim yo ta dwe itilize pou anplifikasyon PCR yo mete dapre diferan rezon rechèch syantifik ak tès klinik.Apre fè yon ti volim, tankou 20ul, ak Lè sa a, fè yon pi gwo volim, ou dwe swiv kondisyon yo, otreman li pral fasil echwe.Rezon fizik: Denaturasyon trè enpòtan pou anplifikasyon PCR.Si tanperati denaturasyon an ba epi tan denaturasyon an kout, fo negatif gen anpil chans rive;tanperati rkwit la twò ba, sa ki ka lakòz anplifikasyon ki pa espesifik epi redwi efikasite anplifikasyon espesifik.Tanperati rkwit la twò wo.Trè afekte obligatwa nan primè ak modèl epi redwi efikasite anplifikasyon PCR.Pafwa li nesesè pou itilize yon tèmomèt estanda pou tcheke tanperati denaturasyon, rkwit ak ekstansyon nan anplifikatè a oswa po idrosolubl.Sa a se tou youn nan rezon ki fè echèk PCR.Varyasyon sekans sib: Si sekans sib la mitasyon oswa efase, ki afekte espesifik obligatwa Jadendanfan an ak modèl la, oswa Jadendanfan an ak modèl pèdi sekans konplemantè a akòz efase yon sèten segman nan sekans sib la, anplifikasyon PCR la. pa pral gen siksè.
2.false pozitif Bann anplifikasyon PCR ki parèt ki konsistan avèk gwoup sekans sib la, epi pafwa gwoup la gen plis lòd ak pi klere.Konsepsyon Jadendanfan ki pa apwopriye: Sekans anplifikasyon chwazi a gen omoloji ak sekans anplifikasyon ki pa sib, kidonk lè w ap fè anplifikasyon PCR, pwodwi PCR anplifye a se yon sekans ki pa sib.Si sekans sib la twò kout oswa Jadendanfan an twò kout, fo pozitif ka fasilman rive.Primer yo bezwen reamenaje.Kwa-kontaminasyon nan sekans sib oswa pwodwi anplifikasyon: Gen de rezon pou kontaminasyon sa a: Premyèman, kwa-kontaminasyon nan tout genòm nan oswa gwo fragman, ki mennen nan fo pozitif.Fo pozitif sa a ka rezoud pa metòd sa yo: Fè atansyon ak dou lè w ap opere pou anpeche sekans sib la aspire nan zam echantiyon an oswa pwojeksyon soti nan tib santrifij la.Eksepte pou anzim ak sibstans ki pa ka kenbe tèt ak tanperati ki wo, tout reyaktif oswa ekipman yo ta dwe esterilize pa presyon ki wo.Tout tib santrifij ak pwent pipèt echantiyon yo ta dwe itilize yon fwa.Si sa nesesè, tib reyaksyon yo ak reyaktif yo iradyasyon ak limyè iltravyolèt anvan yo ajoute echantiyon an pou detwi asid nikleyik yo prezan.Dezyèm lan se kontaminasyon ti fragman asid nikleyik nan lè a.Ti fragman sa yo pi kout pase sekans sib la, men gen sèten omoloji.Yo ka spliced youn ak lòt, epi apre yo fin konplemantè ak primè yo, pwodwi PCR yo ka anplifye, sa ki lakòz fo pozitif, ki ka redwi oswa elimine pa metòd PCR enbrike.
3.Bann anplifikasyon ki pa espesifik parèt Gwoup ki parèt apre anplifikasyon PCR yo enkonsistan ak gwosè espere a, swa pi gwo oswa pi piti, oswa toude gwoup anplifikasyon espesifik ak gwoup anplifikasyon ki pa espesifik parèt an menm tan.Rezon ki fè yo parèt nan bann ki pa espesifik yo se: premye, primè yo pa konplètman konplemantè ak sekans sib la, oswa primè yo total pou fòme dimè.Dezyèm rezon an se ke konsantrasyon an Mg2 + ion twò wo, tanperati a annealing twò ba, ak kantite sik PCR twò wo.Dezyèm faktè a se bon jan kalite a ak kantite anzim la.Anzim ki soti nan kèk sous yo souvan gen tandans fè bann ki pa espesifik men anzim ki soti nan lòt sous pa fè sa.Kantite twòp nan anzim ka pafwa mennen nan anplifikasyon ki pa espesifik.Kontremezi yo genyen ladan yo: redesign primer si sa nesesè.Diminye kantite anzim oswa ranplase li ak yon lòt sous.Diminye kantite primè, ogmante kantite modèl kòmsadwa, epi redwi kantite sik.Ogmante tanperati a annealing yon fason ki apwopriye oswa itilize metòd la pwen de-tanperati (denaturasyon nan 93 ° C, annealing ak ekstansyon alantou 65 ° C).
4.Faky trennen oswa smears parèt PCR anplifikasyon pafwa parèt kòm bann smeared, bann fèy tankou bann oswa bann tankou tapi.Rezon ki fè yo souvan koze pa twòp anzim oswa bon jan kalite pòv nan anzim, twò wo konsantrasyon dNTP, twò wo konsantrasyon Mg2 +, twò ba tanperati rkwir, ak twòp sik.Kontre mezi yo enkli: ① Diminye kantite anzim, oswa ranplase anzim la ak yon lòt sous.②Diminye konsantrasyon dNTP.Byen redwi konsantrasyon Mg2+ la.Ogmante kantite modèl epi redwi kantite sik