FAQ PCR 1. Negatif palsu, ora ana pita amplifikasi sing katon 2. Positif palsu 3. Pita amplifikasi non-spesifik katon 4. Strip seret utawa strip smear katon:
1 Negatif palsu, ora ana pita sing digedhekake Aspek utama reaksi PCR yaiku
① persiapan asam nukleat cithakan
② kualitas primer lan spesifik
③ kualitas enzim lan
④ Kondisi siklus PCR.Kanggo nemokake alasan, analisis lan riset uga kudu ditindakake ing pranala ing ndhuwur.
Cithakan:
① Cithakan ngandhut protein impurity
② Cithakan ngandhut inhibitor enzim Taq
③ Protein ing cithakan ora dicerna lan dibusak, utamane histon ing kromosom
④ Kakehan sing ilang sajrone ekstraksi lan nyiapake cithakan, utawa fenol dihirup
⑤Asam nukleat cithakan ora rampung denaturasi.Nalika kualitas enzim lan primer apik, yen pita amplifikasi ora katon, kemungkinan ana sing salah karo proses pencernaan spesimen utawa proses ekstraksi asam nukleat cithakan.Mulane, solusi pencernaan sing efektif lan stabil kudu disiapake, lan prosedur kasebut kudu didandani lan ora kudu diowahi..Enzim inaktivasi: Perlu ngganti enzim anyar, utawa nggunakake enzim lawas lan anyar bebarengan kanggo nganalisa apa negatif palsu disebabake mundhut utawa aktivitas enzim sing ora cukup.Perlu dicathet menawa kadhangkala enzim Taq dilalekake.Primers: Kualitas primer, konsentrasi primer, lan manawa konsentrasi loro primer simetris minangka alasan umum kanggo kegagalan PCR utawa pita amplifikasi sing ora nyenengake lan difusi gampang.Ana masalah karo kualitas sintesis primer ing sawetara kumpulan.Salah siji saka rong primer nduweni konsentrasi dhuwur lan liyane nduweni konsentrasi sing kurang, nyebabake amplifikasi asimetris sing kurang efisien.
Penanggulangan kasebut yaiku:
① Pilih unit sintesis primer sing apik.
② Konsentrasi primer ngirim ora mung katon ing Nilai OD, nanging uga mbayar manungsa waé kanggo solusi Simpenan primer kanggo elektroforesis gel agarose.Mesthi ana pita primer, lan padhange rong pita primer kudu kira-kira padha.Contone, siji primer duwe pita lan primer liyane ora duwe pita.Kanggo ngudani, PCR bisa gagal ing wektu iki lan kudu ditanggulangi liwat rembugan karo unit sintesis primer.Yen siji primer duwe padhang dhuwur lan liyane kurang padhange, imbangi konsentrasi nalika ngencerake primer.
③ Primer kudu disimpen ing konsentrasi dhuwur lan jumlah cilik kanggo nyegah pembekuan lan thawing utawa panyimpenan jangka panjang ing kulkas, sing bisa nyebabake rusak lan degradasi primer.
④Desain sepisanan ora wajar, kayata dawa sepisanan ora cukup, dimer dibentuk ing antarane sepisanan, lan liya-liyane. Konsentrasi Mg2+: Konsentrasi ion Mg2+ duweni pengaruh gedhe marang efisiensi amplifikasi PCR.Yen konsentrasi dhuwur banget, bisa nyuda spesifik amplifikasi PCR.Yen konsentrasi banget kurang, bakal mengaruhi asil amplifikasi PCR lan malah nyebabake amplifikasi PCR gagal tanpa amplifikasi pita.Owah-owahan ing volume reaksi: Biasane volume sing digunakake kanggo amplifikasi PCR yaiku 20ul, 30ul, lan 50ul.Utawa 100ul, volume apa sing kudu digunakake kanggo amplifikasi PCR disetel miturut macem-macem tujuan riset ilmiah lan uji klinis.Sawise nggawe volume cilik, kayata 20ul, banjur nggawe volume sing luwih gedhe, sampeyan kudu ngetutake kondisi kasebut, yen ora bakal gampang gagal.Alasan fisik: Denaturasi penting banget kanggo amplifikasi PCR.Yen suhu denaturasi kurang lan wektu denaturasi cendhak, kemungkinan negatif palsu bakal kedadeyan;suhu annealing banget kurang, kang bisa nimbulaké amplifikasi non-tartamtu lan nyuda efficiency amplifikasi tartamtu.Suhu annealing dhuwur banget.Highly mengaruhi naleni primer kanggo cithakan lan nyuda efficiency amplifikasi PCR.Kadhangkala perlu nggunakake termometer standar kanggo mriksa suhu denaturasi, annealing lan extension ing amplifier utawa pot larut banyu.Iki uga minangka salah sawijining sebab kegagalan PCR.variasi urutan Target: Yen urutan target mutasi utawa dibusak, kang mengaruhi naleni tartamtu saka sepisanan kanggo cithakan, utawa sepisanan lan cithakan ilang urutan pelengkap amarga pambusakan saka bagean tartamtu saka urutan target, amplifikasi PCR. ora bakal sukses.
2.palsu positif Pita amplifikasi PCR sing katon konsisten karo pita urutan target, lan kadhangkala pita kasebut luwih teratur lan luwih cerah.Desain primer sing ora cocog: Urutan amplifikasi sing dipilih nduweni homologi karo urutan amplifikasi non-target, mula nalika nindakake amplifikasi PCR, produk PCR sing digedhekake minangka urutan non-target.Yen urutan target cendhak banget utawa primer cendhak banget, positip palsu bisa gampang kedadeyan.Primer kudu didesain ulang.Kontaminasi silang saka urutan target utawa produk amplifikasi: Ana rong alasan kanggo kontaminasi iki: Kaping pisanan, kontaminasi silang kabeh genom utawa pecahan gedhe, sing nyebabake positip palsu.Positif palsu iki bisa ditanggulangi kanthi cara ing ngisor iki: Ati-ati lan lembut nalika ngoperasikake supaya urutan target ora disedot menyang pistol sampel utawa cipratan metu saka tabung centrifuge.Kajaba enzim lan zat sing ora bisa tahan suhu dhuwur, kabeh reagen utawa peralatan kudu disterilisasi kanthi tekanan dhuwur.Kabeh tabung centrifuge lan tip pipette injeksi sampel kudu digunakake sapisan.Yen perlu, tabung reaksi lan reagen disinari nganggo sinar ultraviolet sadurunge nambahake spesimen kanggo ngrusak asam nukleat sing ana.Kapindho yaiku kontaminasi pecahan cilik asam nukleat ing udara.Pecahan cilik iki luwih cendhek tinimbang urutan target, nanging nduweni homologi tartamtu.Bisa disambungake, lan sawise dadi pelengkap kanggo primer, produk PCR bisa digedhekake, nyebabake positif palsu, sing bisa dikurangi utawa diilangi kanthi cara PCR nested.
3. Pita amplifikasi non-spesifik katon Pita sing katon sawise amplifikasi PCR ora konsisten karo ukuran sing dikarepake, luwih gedhe utawa luwih cilik, utawa loro pita amplifikasi spesifik lan pita amplifikasi non-spesifik katon bebarengan.Alesan kanggo munculé pita non-spesifik yaiku: pisanan, primer ora lengkap nglengkapi urutan target, utawa primer aggregate kanggo mbentuk dimer.Alesan kapindho yaiku konsentrasi ion Mg2 + dhuwur banget, suhu anil banget, lan jumlah siklus PCR dhuwur banget.Faktor kapindho yaiku kualitas lan jumlah enzim.Enzim saka sawetara sumber asring rawan pita non-spesifik nanging enzim saka sumber liya ora.Jumlah enzim sing berlebihan kadhangkala bisa nyebabake amplifikasi non-spesifik.Penanggulangan kasebut kalebu: desain ulang primer yen perlu.Ngurangi jumlah enzim utawa ngganti karo sumber liyane.Ngurangi jumlah primer, nambah jumlah cithakan kanthi tepat, lan nyuda jumlah siklus.Tambah suhu anil kanthi tepat utawa gunakake metode titik rong suhu (denaturasi ing 93°C, anil lan ekstensi watara 65°C).
4.Flaky seret utawa smears katon amplifikasi PCR kadhangkala katon minangka smeared bands, sheet-kaya band utawa karpet-kaya band.Alasan kasebut asring disebabake dening enzim sing akeh banget utawa kualitas enzim sing ora apik, konsentrasi dNTP sing dhuwur banget, konsentrasi Mg2+ sing dhuwur banget, suhu anil sing kurang, lan siklus sing akeh banget.Penanggulangan kasebut kalebu: ① Ngurangi jumlah enzim, utawa ngganti enzim karo sumber liyane.②Ngurangi konsentrasi dNTP.Ngurangi konsentrasi Mg2+ kanthi tepat.Tambah jumlah cithakan lan nyuda jumlah siklus