PCR FAQ 1. អវិជ្ជមានមិនពិត គ្មានក្រុម amplification លេចឡើង 2. False positive 3. non-specific amplification bands លេចឡើង 4. Flaky drag strips ឬ smear strips លេចឡើង:

1False negative, no amplified band លេចឡើង ទិដ្ឋភាពសំខាន់នៃប្រតិកម្ម PCR គឺ

① ការរៀបចំអាស៊ីត nucleic គំរូ

② គុណភាពនិងភាពជាក់លាក់

③ គុណភាពអង់ស៊ីម និង

④ លក្ខខណ្ឌនៃវដ្ត PCR ។ដើម្បីស្វែងរកមូលហេតុ ការវិភាគ និងស្រាវជ្រាវក៏គួរតែធ្វើឡើងនៅលើតំណភ្ជាប់ខាងលើផងដែរ។

គំរូ៖

① គំរូមានប្រូតេអ៊ីនមិនបរិសុទ្ធ

② គំរូមានផ្ទុកអង់ស៊ីម Taq inhibitors

③ ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងគំរូមិនត្រូវបានរំលាយ និងដកចេញទេ ជាពិសេសអ៊ីស្តូននៅក្នុងក្រូម៉ូសូម

④ ការបាត់បង់ច្រើនពេកក្នុងអំឡុងពេលស្រង់ចេញ និងការរៀបចំគំរូ ឬ phenol ត្រូវបានស្រូបចូល

⑤អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគំរូមិនមានលក្ខណៈពេញលេញទេ។នៅពេលដែលគុណភាពនៃអង់ស៊ីម និងសារធាតុ primers ល្អ ប្រសិនបើ amplification bands មិនលេចឡើង វាទំនងជាមានអ្វីមួយខុសជាមួយនឹងដំណើរការរំលាយអាហារនៃគំរូ ឬដំណើរការទាញយកអាស៊ីត nucleic គំរូ។ដូច្នេះដំណោះស្រាយការរំលាយអាហារដែលមានប្រសិទ្ធភាពនិងមានស្ថេរភាពត្រូវតែត្រូវបានរៀបចំហើយនីតិវិធីគួរតែត្រូវបានជួសជុលហើយមិនគួរត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរតាមឆន្ទៈ។.អង់ស៊ីមអសកម្ម៖ ចាំបាច់ត្រូវជំនួសអង់ស៊ីមថ្មី ឬប្រើអង់ស៊ីមចាស់ និងថ្មីក្នុងពេលតែមួយ ដើម្បីវិភាគថាតើអវិជ្ជមានក្លែងក្លាយបណ្តាលមកពីការបាត់បង់ ឬសកម្មភាពអង់ស៊ីមមិនគ្រប់គ្រាន់។វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាជួនកាលអង់ស៊ីម Taq ត្រូវបានបំភ្លេចចោល។Primers: គុណភាព primer ការផ្តោតអារម្មណ៍ primer និងថាតើការប្រមូលផ្តុំ primers ទាំងពីរមានភាពស៊ីមេទ្រីគឺជាហេតុផលទូទៅសម្រាប់ការបរាជ័យ PCR ឬ bands amplification មិនពេញចិត្ត និងការសាយភាយងាយស្រួល។មានបញ្ហាជាមួយនឹងគុណភាពនៃការសំយោគ primer នៅក្នុងបាច់មួយចំនួន។មួយក្នុងចំនោម primers ទាំងពីរមានកំហាប់ខ្ពស់ ហើយមួយទៀតមានកំហាប់ទាប ដែលធ្វើអោយ amplification asymmetric មានប្រសិទ្ធភាពទាប។

វិធានការប្រឆាំងគឺ៖

① ជ្រើសរើសឯកតាសំយោគបឋមល្អ។

② ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ primers មិនគួរមើលត្រឹមតែតម្លៃ OD ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងយកចិត្តទុកដាក់ចំពោះដំណោះស្រាយ primer stock សម្រាប់ agarose gel electrophoresis ផងដែរ។ត្រូវតែមានស្រទាប់ primer ហើយពន្លឺនៃ primer bands ទាំងពីរគួរតែមានប្រហែលដូចគ្នា។ឧទាហរណ៍ primer មួយមាន band ហើយ primer ផ្សេងទៀតមិនមាន band ។សម្រាប់បន្ទះ PCR អាចនឹងបរាជ័យនៅពេលនេះ ហើយគួរតែត្រូវបានដោះស្រាយតាមរយៈការចរចាជាមួយអង្គភាពសំយោគបឋម។ប្រសិនបើ primer មួយមានពន្លឺខ្ពស់ ហើយមួយទៀតមានពន្លឺទាប ធ្វើឱ្យមានតុល្យភាពរវាងការប្រមូលផ្តុំនៅពេល diluting primers ។

③ primers គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងកំហាប់ខ្ពស់ និងក្នុងបរិមាណតិចតួច ដើម្បីការពារការកកម្តងហើយម្តងទៀត និងការរលាយ ឬការផ្ទុករយៈពេលវែងនៅក្នុងទូទឹកកក ដែលអាចនាំអោយ primers ខូច និងរិចរិល។

④ ការរចនា primer គឺមិនសមហេតុផលទេ ដូចជាប្រវែង primer គឺមិនគ្រប់គ្រាន់ dimers ត្រូវបានបង្កើតឡើងរវាង primers ជាដើម។ប្រសិនបើកំហាប់ខ្ពស់ពេក វាអាចកាត់បន្ថយភាពជាក់លាក់នៃការពង្រីក PCR ។ប្រសិនបើកំហាប់ទាបពេក វានឹងប៉ះពាល់ដល់ទិន្នផលពង្រីក PCR ហើយថែមទាំងធ្វើឱ្យ PCR amplification បរាជ័យដោយមិនបាច់ពង្រីក។ការផ្លាស់ប្តូរបរិមាណប្រតិកម្ម៖ ជាធម្មតាបរិមាណដែលប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR គឺ 20ul, 30ul និង 50ul។ឬ 100ul តើបរិមាណអ្វីដែលគួរប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR ត្រូវបានកំណត់ដោយគោលបំណងផ្សេងគ្នានៃការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ និងការធ្វើតេស្តគ្លីនិក។បន្ទាប់ពីធ្វើបរិមាណតូចមួយដូចជា 20ul ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យបរិមាណធំជាងនេះអ្នកត្រូវតែធ្វើតាមលក្ខខណ្ឌបើមិនដូច្នេះទេវានឹងបរាជ័យយ៉ាងងាយស្រួល។ហេតុផលរូបវន្ត៖ ការប្រែពណ៌មានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់ការពង្រីក PCR ។ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាព denaturation មានកម្រិតទាប ហើយរយៈពេល denaturation គឺខ្លី អវិជ្ជមានមិនពិតទំនងជានឹងកើតឡើង។សីតុណ្ហភាព annealing គឺទាបពេកដែលអាចបណ្តាលឱ្យ amplification មិនជាក់លាក់និងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព amplification ជាក់លាក់។សីតុណ្ហ​ភាព​នៃ​ការ​ដុត​គឺ​ខ្ពស់​ពេក។ប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ការចងនៃ primers ទៅនឹងគំរូ និងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព PCR amplification ។ពេលខ្លះ ចាំបាច់ត្រូវប្រើទែម៉ូម៉ែត្រស្តង់ដារ ដើម្បីពិនិត្យមើលសីតុណ្ហភាព denaturation, annealing និង extension នៅក្នុង amplifier ឬ pot-soluble pot។នេះក៏ជាហេតុផលមួយសម្រាប់ការបរាជ័យ PCR ផងដែរ។បំរែបំរួលនៃលំដាប់គោលដៅ៖ ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ឬលុប ដែលប៉ះពាល់ដល់ការភ្ជាប់ជាក់លាក់នៃ primer ទៅគំរូ ឬ primer និង template បាត់បង់លំដាប់បំពេញបន្ថែមដោយសារតែការលុបផ្នែកជាក់លាក់នៃលំដាប់គោលដៅនោះ PCR amplification នឹងមិនជោគជ័យទេ។

2.false positive ក្រុម PCR amplification band ដែលលេចឡើងគឺស្របជាមួយនឹងក្រុមតន្រ្តីលំដាប់គោលដៅ ហើយជួនកាលក្រុមតន្រ្តីមានសណ្តាប់ធ្នាប់ និងភ្លឺជាង។ការរចនាបឋមមិនសមរម្យ៖ លំដាប់ amplification ដែលបានជ្រើសរើសមានភាពដូចគ្នាជាមួយនឹងលំដាប់ amplification ដែលមិនមែនជាគោលដៅ ដូច្នេះនៅពេលអនុវត្ត PCR amplification ផលិតផល PCR amplified គឺជាលំដាប់ដែលមិនមែនជាគោលដៅ។ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅខ្លីពេក ឬបឋមខ្លីពេក ភាពវិជ្ជមានមិនពិតអាចកើតឡើងយ៉ាងងាយ។Primers ត្រូវការការរចនាឡើងវិញ។ការចម្លងមេរោគឆ្លងតាមលំដាប់គោលដៅ ឬផលិតផលពង្រីក៖ មានហេតុផលពីរសម្រាប់ការចម្លងរោគនេះ៖ ទីមួយ ការចម្លងមេរោគឆ្លងនៃហ្សែនទាំងមូល ឬបំណែកធំ ដែលនាំទៅរកភាពវិជ្ជមានមិនពិត។ភាពវិជ្ជមានមិនពិតនេះអាចត្រូវបានដោះស្រាយដោយវិធីដូចខាងក្រោមនេះ៖ ត្រូវប្រុងប្រយ័ត្ន និងសុភាពរាបសារនៅពេលប្រតិបត្តិការ ដើម្បីការពារលំដាប់គោលដៅពីការជញ្ជក់ចូលទៅក្នុងកាំភ្លើងគំរូ ឬខ្ទាតចេញពីបំពង់ centrifuge ។លើកលែងតែអង់ស៊ីម និងសារធាតុដែលមិនអាចទប់ទល់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ សារធាតុប្រតិកម្ម ឬឧបករណ៍ទាំងអស់គួរតែត្រូវបានក្រៀវដោយសម្ពាធខ្ពស់។បំពង់ centrifuge ទាំងអស់ និងគន្លឹះចាក់ថ្នាំគំរូគួរតែត្រូវបានប្រើម្តង។បើចាំបាច់ បំពង់ប្រតិកម្ម និងសារធាតុ reagents ត្រូវបាន irradiated ជាមួយពន្លឺ ultraviolet មុនពេលបន្ថែមសំណាកដើម្បីបំផ្លាញអាស៊ីត nucleic ដែលមានវត្តមាន។ទីពីរគឺការចម្លងរោគនៃបំណែកតូចៗនៃអាស៊ីត nucleic នៅក្នុងខ្យល់។បំណែកតូចៗទាំងនេះខ្លីជាងលំដាប់គោលដៅ ប៉ុន្តែមានភាពដូចគ្នាជាក់លាក់។ពួកវាអាចផ្សាភ្ជាប់គ្នាទៅវិញទៅមក ហើយបន្ទាប់ពីត្រូវបានបំពេញបន្ថែមទៅនឹងថ្នាំ primers ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានពង្រីក ដែលបណ្តាលឱ្យមានភាពវិជ្ជមានមិនពិត ដែលអាចត្រូវបានកាត់បន្ថយ ឬលុបបំបាត់ដោយវិធីសាស្ត្រ PCR ដែលត្រូវបានដាក់។

 

3.Non-specific amplification bands លេចឡើង ក្រុមតន្រ្តីដែលលេចឡើងបន្ទាប់ពីការពង្រីក PCR គឺមិនស៊ីគ្នានឹងទំហំដែលរំពឹងទុក ទាំងធំជាង ឬតូចជាង ឬទាំងពីរក្រុម amplification ជាក់លាក់ និងក្រុម amplification មិនជាក់លាក់លេចឡើងក្នុងពេលតែមួយ។ហេតុផលសម្រាប់ការលេចឡើងនៃក្រុមតន្រ្តីមិនជាក់លាក់គឺ: ទីមួយ primers មិនត្រូវបានបំពេញបន្ថែមទាំងស្រុងទៅនឹងលំដាប់គោលដៅឬ primers សរុបដើម្បីបង្កើត dimers ។មូលហេតុទីពីរគឺថាកំហាប់អ៊ីយ៉ុង Mg2+ ខ្ពស់ពេក សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក ហើយចំនួននៃវដ្ត PCR គឺខ្ពស់ពេក។កត្តាទីពីរគឺគុណភាព និងបរិមាណនៃអង់ស៊ីម។អង់ស៊ីមពីប្រភពមួយចំនួន ច្រើនតែងាយនឹងក្រុមមិនជាក់លាក់ ប៉ុន្តែអង់ស៊ីមពីប្រភពផ្សេងទៀតមិនមានទេ។បរិមាណអង់ស៊ីមច្រើនពេក ជួនកាលអាចនាំទៅរកការពង្រីកមិនជាក់លាក់។វិធានការតបតរួមមានៈ រៀបចំឡើងវិញនូវ primers បើចាំបាច់។កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬជំនួសវាដោយប្រភពផ្សេងទៀត។កាត់បន្ថយបរិមាណ primers បង្កើនបរិមាណនៃគំរូឱ្យបានត្រឹមត្រូវនិងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត។បង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing ឱ្យសមស្រប ឬប្រើវិធីពីរ-temperature point (denaturation at 93°C, annealing and extension around 65°C)។

 

4. ការអូស ឬស្នាមប្រេះលេចឡើង ជួនកាល PCR amplification លេចឡើងជាបន្ទះដែលលាបពណ៌ បន្ទះដូចសន្លឹក ឬខ្សែដូចកំរាលព្រំ។ហេតុផលជារឿយៗបណ្តាលមកពីអង់ស៊ីមច្រើនពេក ឬគុណភាពអន់នៃអង់ស៊ីម កំហាប់ dNTP ខ្ពស់ពេក កំហាប់ Mg2+ ខ្ពស់ពេក សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក និងវដ្តច្រើនពេក។វិធានការប្រឆាំងរួមមានៈ ① កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬជំនួសអង់ស៊ីមជាមួយប្រភពផ្សេងទៀត។②កាត់បន្ថយការប្រមូលផ្តុំ dNTP ។កាត់បន្ថយកំហាប់ Mg2+ ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។បង្កើនចំនួនគំរូ និងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត