Soalan Lazim PCR 1. Negatif palsu, tiada jalur amplifikasi muncul 2. Positif palsu 3. Jalur amplifikasi tidak spesifik muncul 4. Jalur seretan mengelupas atau jalur smear muncul：
1 Negatif palsu, tiada jalur yang dikuatkan muncul Aspek utama tindak balas PCR ialah
① penyediaan asid nukleik templat
② kualiti primer dan kekhususan
③ kualiti enzim dan
④ Keadaan kitaran PCR.Untuk mencari sebab-sebabnya, analisis dan kajian juga perlu dilakukan pada pautan di atas.
Templat:
① Templat mengandungi protein kekotoran
② Templat mengandungi perencat enzim Taq
③ Protein dalam templat tidak dicerna dan dikeluarkan, terutamanya histon dalam kromosom
④ Terlalu banyak yang hilang semasa pengekstrakan dan penyediaan templat, atau fenol telah dihidu
⑤Asid nukleik templat tidak didenatur sepenuhnya.Apabila kualiti enzim dan primer adalah baik, jika jalur amplifikasi tidak muncul, kemungkinan besar terdapat sesuatu yang tidak kena dengan proses penghadaman spesimen atau proses pengekstrakan asid nukleik templat.Oleh itu, penyelesaian pencernaan yang berkesan dan stabil mesti disediakan, dan prosedurnya harus diperbaiki dan tidak boleh diubah sesuka hati..Penyahaktifan enzim: Adalah perlu untuk menggantikan enzim baharu, atau menggunakan kedua-dua enzim lama dan baharu pada masa yang sama untuk menganalisis sama ada negatif palsu disebabkan oleh kehilangan atau aktiviti enzim yang tidak mencukupi.Perlu diingatkan bahawa kadangkala enzim Taq dilupakan.Primer: Kualiti primer, kepekatan primer, dan sama ada kepekatan kedua-dua primer adalah simetri adalah sebab biasa kegagalan PCR atau jalur amplifikasi yang tidak memuaskan dan penyebaran mudah.Terdapat masalah dengan kualiti sintesis primer dalam beberapa kelompok.Satu daripada dua primer mempunyai kepekatan tinggi dan satu lagi mempunyai kepekatan rendah, menghasilkan penguatan asimetri kecekapan rendah.
Tindakan balas adalah:
① Pilih unit sintesis primer yang baik.
② Kepekatan primer bukan sahaja perlu melihat nilai OD, tetapi juga memberi perhatian kepada larutan stok primer untuk elektroforesis gel agarose.Mesti ada jalur primer dan kecerahan dua jalur primer haruslah lebih kurang sama.Sebagai contoh, satu buku asas mempunyai jalur dan satu lagi buku asas tidak mempunyai jalur.Untuk jalur, PCR mungkin gagal pada masa ini dan harus diselesaikan melalui rundingan dengan unit sintesis primer.Jika satu primer mempunyai kecerahan tinggi dan satu lagi mempunyai kecerahan rendah, seimbangkan kepekatan apabila mencairkan primer.
③ Primer hendaklah disimpan dalam kepekatan tinggi dan kuantiti yang kecil untuk mengelakkan pembekuan dan pencairan berulang atau penyimpanan jangka panjang di dalam peti sejuk, yang boleh menyebabkan kemerosotan dan degradasi primer.
④Reka bentuk primer tidak munasabah, seperti panjang primer tidak mencukupi, dimer terbentuk antara primer, dsb. Kepekatan Mg2+: Kepekatan ion Mg2+ mempunyai pengaruh yang besar terhadap kecekapan amplifikasi PCR.Jika kepekatan terlalu tinggi, ia boleh mengurangkan kekhususan penguatan PCR.Jika kepekatan terlalu rendah, ia akan menjejaskan hasil penguatan PCR dan juga menyebabkan penguatan PCR gagal tanpa jalur penguatan.Perubahan isipadu tindak balas: Biasanya isipadu yang digunakan untuk penguatan PCR ialah 20ul, 30ul, dan 50ul.Atau 100ul, jumlah yang harus digunakan untuk amplifikasi PCR ditetapkan mengikut tujuan penyelidikan saintifik dan ujian klinikal yang berbeza.Selepas membuat volum kecil, seperti 20ul, dan kemudian membuat volum yang lebih besar, anda mesti mengikut syarat, jika tidak, ia akan gagal dengan mudah.Sebab fizikal: Denaturasi sangat penting untuk penguatan PCR.Jika suhu denaturasi rendah dan masa denaturasi adalah pendek, negatif palsu berkemungkinan besar berlaku;suhu penyepuhlindapan terlalu rendah, yang boleh menyebabkan penguatan bukan khusus dan mengurangkan kecekapan penguatan khusus.Suhu penyepuhlindapan terlalu tinggi.Sangat mempengaruhi pengikatan primer pada templat dan mengurangkan kecekapan amplifikasi PCR.Kadangkala perlu menggunakan termometer standard untuk memeriksa suhu denaturasi, penyepuhlindapan dan lanjutan dalam penguat atau periuk larut air.Ini juga merupakan salah satu sebab kegagalan PCR.Variasi jujukan sasaran: Jika jujukan sasaran dimutasi atau dipadamkan, yang menjejaskan pengikatan khusus primer pada templat, atau primer dan templat kehilangan jujukan pelengkap akibat pemadaman segmen tertentu jujukan sasaran, penguatan PCR tidak akan berjaya.
2. positif palsu Jalur amplifikasi PCR yang muncul adalah konsisten dengan jalur jujukan sasaran, dan kadangkala jalur itu lebih teratur dan lebih cerah.Reka bentuk primer yang tidak sesuai: Urutan penguatan yang dipilih mempunyai homologi dengan urutan penguatan bukan sasaran, jadi apabila melakukan penguatan PCR, produk PCR yang dikuatkan ialah urutan bukan sasaran.Jika urutan sasaran terlalu pendek atau buku asas terlalu pendek, positif palsu boleh berlaku dengan mudah.Primer perlu direka bentuk semula.Pencemaran silang jujukan sasaran atau produk penguatan: Terdapat dua sebab untuk pencemaran ini: Pertama, pencemaran silang keseluruhan genom atau serpihan besar, yang membawa kepada positif palsu.Positif palsu ini boleh diselesaikan dengan kaedah berikut: Berhati-hati dan lembut semasa beroperasi untuk mengelakkan urutan sasaran daripada disedut ke dalam pistol sampel atau terpercik keluar dari tiub emparan.Kecuali enzim dan bahan yang tidak dapat menahan suhu tinggi, semua reagen atau peralatan hendaklah disterilkan dengan tekanan tinggi.Semua tiub emparan dan tip pipet suntikan sampel hendaklah digunakan sekali.Jika perlu, tiub tindak balas dan reagen disinari dengan cahaya ultraungu sebelum menambah spesimen untuk memusnahkan asid nukleik yang ada.Yang kedua ialah pencemaran serpihan kecil asid nukleik di udara.Serpihan kecil ini lebih pendek daripada jujukan sasaran, tetapi mempunyai homologi tertentu.Mereka boleh disambung antara satu sama lain, dan selepas menjadi pelengkap kepada primer, produk PCR boleh dikuatkan, menghasilkan positif palsu, yang boleh dikurangkan atau dihapuskan dengan kaedah PCR bersarang.
3. Jalur amplifikasi bukan khusus muncul Jalur yang muncul selepas amplifikasi PCR tidak konsisten dengan saiz yang dijangkakan, sama ada lebih besar atau lebih kecil, atau kedua-dua jalur amplifikasi khusus dan jalur amplifikasi bukan spesifik muncul pada masa yang sama.Sebab-sebab kemunculan jalur bukan khusus ialah: pertama, primer tidak sepenuhnya melengkapi jujukan sasaran, atau primer beragregat membentuk dimer.Sebab kedua ialah kepekatan ion Mg2+ terlalu tinggi, suhu penyepuhlindapan terlalu rendah, dan bilangan kitaran PCR terlalu tinggi.Faktor kedua ialah kualiti dan kuantiti enzim.Enzim daripada beberapa sumber selalunya terdedah kepada jalur tidak spesifik tetapi enzim daripada sumber lain tidak.Jumlah enzim yang berlebihan kadangkala boleh membawa kepada penguatan tidak spesifik.Tindakan balas termasuk: reka bentuk semula primer jika perlu.Kurangkan jumlah enzim atau gantikan dengan sumber lain.Kurangkan jumlah primer, tingkatkan jumlah templat dengan sewajarnya, dan kurangkan bilangan kitaran.Tingkatkan suhu penyepuhlindapan dengan sewajarnya atau gunakan kaedah titik dua suhu (denaturasi pada 93°C, penyepuhlindapan dan lanjutan sekitar 65°C).
4.Seretan berlubang atau calitan kelihatan amplifikasi PCR kadangkala muncul sebagai jalur berlumur, jalur seperti lembaran atau jalur seperti permaidani.Sebabnya selalunya disebabkan oleh terlalu banyak enzim atau kualiti enzim yang rendah, kepekatan dNTP yang terlalu tinggi, kepekatan Mg2+ yang terlalu tinggi, suhu penyepuhlindapan yang terlalu rendah, dan terlalu banyak kitaran.Tindakan balas termasuk: ① Kurangkan jumlah enzim, atau gantikan enzim dengan sumber lain.②Kurangkan kepekatan dNTP.Kurangkan kepekatan Mg2+ dengan sewajarnya.Tingkatkan jumlah templat dan kurangkan bilangan kitaran