PCR FAQ 1. गलत नकारात्मक, कुनै एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड देखा पर्दैन 2. गलत सकारात्मक 3. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्डहरू देखा पर्दछ 4. फ्ल्याकी ड्र्याग स्ट्रिपहरू वा स्मियर स्ट्रिपहरू देखा पर्दछ:

1 गलत नकारात्मक, कुनै एम्प्लीफाइड ब्यान्ड देखा पर्दैन PCR प्रतिक्रियाका मुख्य पक्षहरू हुन्

① टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिडको तयारी

② प्राइमर गुणस्तर र विशिष्टता

③ इन्जाइम गुणस्तर र

④ PCR चक्र अवस्थाहरू।कारणहरू पत्ता लगाउन माथिको लिङ्कहरूमा विश्लेषण र अनुसन्धान पनि सञ्चालन गर्नुपर्छ।

टेम्प्लेट:

① टेम्प्लेटमा अशुद्ध प्रोटीनहरू छन्

② टेम्प्लेटले Taq इन्जाइम अवरोधकहरू समावेश गर्दछ

③ टेम्प्लेटमा भएका प्रोटिनहरू पच्दैनन् र हटाइँदैनन्, विशेष गरी क्रोमोजोमहरूमा रहेका हिस्टोनहरू

④ निकासी र टेम्प्लेटको तयारीको क्रममा धेरै धेरै हराएको थियो, वा फिनोल सास फेरिएको थियो

⑤ टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिड पूर्ण रूपमा विकृत छैन।जब इन्जाइमहरू र प्राइमरहरूको गुणस्तर राम्रो हुन्छ, यदि एम्प्लीफिकेशन ब्यान्डहरू देखा पर्दैनन् भने, नमूनाको पाचन प्रक्रिया वा टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिड निकासी प्रक्रियामा केहि गडबड हुन सक्छ।त्यसकारण, एक प्रभावकारी र स्थिर पाचन समाधान तयार हुनुपर्छ, र प्रक्रिया निश्चित हुनुपर्छ र इच्छामा परिवर्तन गर्नु हुँदैन।।इन्जाइम निष्क्रियता: यो नयाँ इन्जाइम प्रतिस्थापन गर्न आवश्यक छ, वा एकै समयमा पुरानो र नयाँ इन्जाइमहरू प्रयोग गर्नुहोस् कि गलत नकारात्मकहरू हानि वा अपर्याप्त इन्जाइम गतिविधिको कारणले गर्दा विश्लेषण गर्न।यो ध्यान दिनुपर्छ कि कहिलेकाहीं Taq इन्जाइम बिर्सिएको छ। प्राइमरहरू: प्राइमर गुणस्तर, प्राइमर एकाग्रता, र दुई प्राइमरहरूको सांद्रता सममित छ कि छैन PCR विफलता वा असंतोषजनक एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड र सजिलो प्रसारको सामान्य कारणहरू हुन्।केही ब्याचहरूमा प्राइमर संश्लेषणको गुणस्तरमा समस्याहरू छन्।दुई प्राइमरहरू मध्ये एउटामा उच्च एकाग्रता छ र अर्कोमा कम एकाग्रता छ, परिणामस्वरूप कम दक्षता असममित प्रवर्धन हुन्छ।

प्रतिरोधी उपायहरू हुन्:

① राम्रो प्राइमर संश्लेषण इकाई चयन गर्नुहोस्।

② प्राइमरहरूको एकाग्रताले OD मान मात्र हेर्नु हुँदैन, तर agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि प्राइमर स्टक समाधानमा पनि ध्यान दिनुपर्छ।त्यहाँ प्राइमर ब्यान्डहरू हुनुपर्छ, र दुई प्राइमर ब्यान्डहरूको चमक लगभग समान हुनुपर्छ।उदाहरणका लागि, एउटा प्राइमरमा ब्यान्ड हुन्छ र अर्को प्राइमरमा कुनै ब्यान्ड हुँदैन।स्ट्रिपहरूका लागि, PCR यस समयमा असफल हुन सक्छ र प्राइमर संश्लेषण एकाइसँग वार्ताद्वारा समाधान गरिनुपर्छ।यदि एउटा प्राइमर उच्च चमक छ र अर्को कम चमक छ, प्राइमर पातलो गर्दा सांद्रता सन्तुलन।

③ फ्रिजमा बारम्बार चिसो र पग्लिन वा लामो समयसम्म भण्डारण हुनबाट जोगाउन प्राइमरहरूलाई उच्च एकाग्रता र थोरै मात्रामा भण्डारण गर्नुपर्छ, जसले प्राइमरहरू बिग्रन र खस्किन सक्छ।

④प्राइमर डिजाइन अव्यावहारिक छ, जस्तै प्राइमर लम्बाइ पर्याप्त छैन, डाइमरहरू प्राइमरहरू बीच बनाइन्छ, आदि। Mg2+ एकाग्रता: Mg2+ आयन एकाग्रताले PCR प्रवर्धन दक्षतामा ठूलो प्रभाव पार्छ।यदि एकाग्रता धेरै उच्च छ भने, यसले PCR प्रवर्धनको विशिष्टता कम गर्न सक्छ।यदि एकाग्रता धेरै कम छ भने, यसले PCR प्रवर्द्धन उपजलाई असर गर्छ र PCR एम्प्लीफिकेशनलाई एम्प्लीफाइङ्ग ब्यान्ड बिना असफल हुन पनि सक्छ।प्रतिक्रिया भोल्युममा परिवर्तनहरू: सामान्यतया PCR प्रवर्धनको लागि प्रयोग हुने भोल्युमहरू 20ul, 30ul, र 50ul हुन्छन्।वा 100ul, PCR प्रवर्धनको लागि कुन भोल्युम प्रयोग गर्नुपर्छ वैज्ञानिक अनुसन्धान र क्लिनिकल परीक्षणको विभिन्न उद्देश्यहरू अनुसार सेट गरिएको छ।सानो भोल्युम, जस्तै 20ul, र त्यसपछि ठूलो भोल्युम बनाएपछि, तपाईंले सर्तहरू पालना गर्नुपर्छ, अन्यथा यो सजिलै असफल हुनेछ।भौतिक कारणहरू: PCR एम्प्लीफिकेशनको लागि विकृतिकरण धेरै महत्त्वपूर्ण छ।यदि विकृतीकरणको तापमान कम छ र विकृतीकरण समय छोटो छ भने, गलत नकारात्मकहरू हुने सम्भावना धेरै हुन्छ;annealing तापमान धेरै कम छ, जसले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन र विशिष्ट प्रवर्धन दक्षता कम गर्न सक्छ।annealing तापमान धेरै उच्च छ।टेम्प्लेटहरूमा प्राइमरहरूको बाइन्डिङलाई अत्यधिक प्रभाव पार्छ र PCR प्रवर्द्धन दक्षता घटाउँछ।कहिलेकाहीँ एम्प्लीफायर वा पानीमा घुलनशील भाँडोमा विकृतिकरण, एनिलिङ र एक्स्टेन्सन तापमान जाँच गर्न मानक थर्मोमिटर प्रयोग गर्न आवश्यक छ।पीसीआर फेल हुनुको एउटा कारण यो पनि हो ।लक्ष्य अनुक्रम भिन्नता: यदि लक्ष्य अनुक्रम उत्परिवर्तित वा मेटाइएको छ, जसले टेम्प्लेटमा प्राइमरको विशिष्ट बाइन्डिङलाई असर गर्छ, वा प्राइमर र टेम्प्लेटले लक्ष्य अनुक्रमको एक निश्चित खण्ड मेटाउने कारणले पूरक अनुक्रम गुमाउँछ, PCR प्रवर्धन। सफल हुनेछैन।

2. False positive PCR एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड जुन देखिन्छ लक्ष्य अनुक्रम ब्यान्डसँग मिल्दोजुल्दो छ, र कहिलेकाहीँ ब्यान्ड अधिक व्यवस्थित र उज्यालो हुन्छ।अनुपयुक्त प्राइमर डिजाइन: चयन गरिएको एम्प्लीफिकेशन अनुक्रममा गैर-लक्ष्य एम्प्लिफिकेशन अनुक्रमसँग समानता छ, त्यसैले PCR प्रवर्द्धन गर्दा, एम्प्लीफाइड PCR उत्पादन एक गैर-लक्ष्य अनुक्रम हो।यदि लक्ष्य अनुक्रम धेरै छोटो छ वा प्राइमर धेरै छोटो छ भने, झूटा सकारात्मक सजिलै हुन सक्छ।प्राइमरहरू पुन: डिजाइन गर्न आवश्यक छ।लक्ष्य अनुक्रम वा एम्प्लीफिकेशन उत्पादनहरूको क्रस-प्रदूषण: यस प्रदूषणको दुई कारणहरू छन्: पहिलो, सम्पूर्ण जीनोम वा ठूला टुक्राहरूको क्रस-प्रदूषण, झूटा सकारात्मकहरू निम्त्याउँछ।यो झूटा सकारात्मक निम्न विधिहरूद्वारा समाधान गर्न सकिन्छ: नमूना बन्दुकमा चुस्न वा सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबबाट बाहिर निस्कन लक्षित अनुक्रमलाई रोक्नको लागि सञ्चालन गर्दा सावधान र नम्र हुनुहोस्।उच्च तापक्रम सहन नसक्ने इन्जाइमहरू र पदार्थहरू बाहेक, सबै अभिकर्मक वा उपकरणहरू उच्च दबाबद्वारा बाँझ गर्नुपर्छ।सबै सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू र नमूना इंजेक्शन पिपेट टिपहरू एक पटक प्रयोग गर्नुपर्छ।यदि आवश्यक छ भने, प्रतिक्रिया ट्यूबहरू र अभिकर्मकहरूलाई पराबैंगनी प्रकाशको साथ विकिरण गरिएको छ नमूना थप्नु अघि उपस्थित न्यूक्लिक एसिडहरू नष्ट गर्न।दोस्रो हावामा न्यूक्लिक एसिडका साना टुक्राहरूको प्रदूषण हो।यी साना टुक्राहरू लक्ष्य अनुक्रम भन्दा छोटो छन्, तर निश्चित समरूपता छ।तिनीहरूलाई एकअर्कासँग जोड्न सकिन्छ, र प्राइमरहरूको पूरक भएपछि, PCR उत्पादनहरूलाई विस्तार गर्न सकिन्छ, फलस्वरूप झूटा सकारात्मक परिणामहरू, जुन नेस्टेड PCR विधिहरूद्वारा घटाउन वा हटाउन सकिन्छ।

 

3. गैर-विशिष्ट एम्प्लीफिकेशन ब्यान्डहरू देखा पर्छन् PCR एम्प्लीफिकेशन पछि देखा पर्ने ब्यान्डहरू अपेक्षित आकारसँग असंगत छन्, या त ठूला वा सानो, वा दुवै विशिष्ट प्रवर्द्धन ब्यान्डहरू र गैर-विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्डहरू एकै समयमा देखा पर्दछन्।गैर-विशिष्ट ब्यान्डहरूको उपस्थितिको कारणहरू हुन्: पहिलो, प्राइमरहरू लक्ष्य अनुक्रममा पूर्ण रूपमा पूरक हुँदैनन्, वा प्राइमरहरू डाइमरहरू बनाउनको लागि एकत्रित हुन्छन्।दोस्रो कारण Mg2+ आयन सांद्रता धेरै उच्च छ, annealing तापमान धेरै कम छ, र PCR चक्र संख्या धेरै उच्च छ।दोस्रो कारक इन्जाइमको गुणस्तर र मात्रा हो।केहि स्रोतहरूबाट इन्जाइमहरू प्रायः गैर-विशिष्ट ब्यान्डहरूमा प्रवण हुन्छन् तर अन्य स्रोतहरूबाट इन्जाइमहरू छैनन्।इन्जाइमहरूको अत्यधिक मात्राले कहिलेकाहीँ गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको नेतृत्व गर्न सक्छ।काउन्टरमेजरहरूमा समावेश छ: आवश्यक भएमा प्राइमरहरू पुन: डिजाइन गर्नुहोस्।इन्जाइमको मात्रा घटाउनुहोस् वा अर्को स्रोतसँग बदल्नुहोस्।प्राइमरहरूको मात्रा घटाउनुहोस्, उपयुक्त रूपमा टेम्प्लेटको मात्रा बढाउनुहोस्, र चक्रहरूको संख्या घटाउनुहोस्।एनेलिङको तापक्रम उचित रूपमा बढाउनुहोस् वा दुई-तापमान बिन्दु विधि प्रयोग गर्नुहोस् (९३ डिग्री सेल्सियसमा विकृतिकरण, ६५ डिग्री सेल्सियस वरिपरि एनिलिङ र विस्तार)।

 

4. फ्ल्याकी ड्र्याग वा स्मियरहरू देखा पर्छन् PCR एम्प्लीफिकेशन कहिलेकाहीं स्मीयर ब्यान्ड, पाना-जस्तो ब्यान्ड वा कार्पेट-जस्तो ब्यान्डको रूपमा देखिन्छ।कारणहरू प्रायः धेरै इन्जाइम वा इन्जाइमको खराब गुणस्तर, धेरै उच्च dNTP एकाग्रता, धेरै उच्च Mg2+ एकाग्रता, धेरै कम एनिलिङ तापमान, र धेरै चक्रहरूका कारण हुन्छन्।प्रतिरोधी उपायहरूले समावेश गर्दछ: ① इन्जाइमको मात्रा घटाउनुहोस्, वा इन्जाइमलाई अर्को स्रोतमा बदल्नुहोस्।②dNTP को एकाग्रता कम गर्नुहोस्।उचित रूपमा Mg2+ एकाग्रता कम गर्नुहोस्।टेम्प्लेटहरूको मात्रा बढाउनुहोस् र चक्रहरूको संख्या घटाउनुहोस्