د PCR FAQ 1. غلط منفي، هیڅ امپلیفیکیشن بانډ نه ښکاري 2. غلط مثبت 3. غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه څرګندیږي 4. فلکي ډریګ سټریپونه یا سمیر سټیپونه څرګندیږي:

1 غلط منفي، هیڅ پراخ شوی بانډ نه ښکاري د PCR غبرګون کلیدي اړخونه دي

① د کینډی نیوکلیک اسید چمتو کول

② پریمر کیفیت او ځانګړتیا

③ انزایم کیفیت او

④ د PCR دورې شرایط.د دلایلو د موندلو لپاره باید په پورتنیو لینکونو کې هم شننه او څیړنه وشي.

کينډۍ:

① په نمونه کې ناپاک پروټینونه شامل دي

② دا نمونه د Taq انزایم مخنیوی کونکي لري

③ په کینډۍ کې پروټینونه نه هضم کیږي او له مینځه وړل کیږي، په ځانګړې توګه په کروموزوم کې هسټونونه

④ د نمونې د استخراج او چمتو کولو په جریان کې خورا ډیر ضایع شوی، یا فینول تنفس شوی

⑤کینډۍ نیوکلییک اسید په بشپړه توګه له مینځه وړل شوی نه دی.کله چې د انزایمونو او پریمر کیفیت ښه وي، که د امپلیفیکیشن بانډونه څرګند نه وي، نو ډیر احتمال شتون لري چې د نمونې د هضم پروسې یا ټیمپلیټ نیوکلیک اسید استخراج پروسې کې یو څه غلط وي.له همدې امله، د هضم یو اغیزمن او باثباته حل باید چمتو شي، او طرزالعمل باید ثابت شي او باید په خپله خوښه بدل نشي..د انزایمونو غیرفعالیت: دا اړینه ده چې نوي انزایمونه ځای په ځای کړئ ، یا په ورته وخت کې دواړه زاړه او نوي انزایمونه وکاروئ ترڅو دا تحلیل کړئ چې ایا غلط منفي د انزایمونو د ضایع کیدو یا ناکافي فعالیت له امله رامینځته شوي.دا باید په پام کې ونیول شي چې ځینې وختونه د تاق انزایم هیر شوی وي. پرائمر: د پرائمر کیفیت، د پریمر غلظت، او ایا د دوه پرائمر غلظت همغږي دي د PCR د ناکامۍ یا غیر اطمیناني امپلیفیکیشن بندونو او اسانه خپریدو عام لاملونه دي.په ځینو بستونو کې د پریمر ترکیب کیفیت سره ستونزې شتون لري.د دوو پرائمرونو څخه یو یې لوړ غلظت لري او بل یې ټیټ غلظت لري، چې په پایله کې د ټیټ موثریت غیر متناسب امپلیفیکیشن دی.

د مخنیوي تدابیر دا دي:

① یو ښه پریمر ترکیب واحد وټاکئ.

② د پریمر غلظت باید نه یوازې د OD ارزښت ته وګوري ، بلکه د اګرز جیل الیکٹروفورسیس لپاره د پریمر سټاک محلول ته هم پاملرنه وکړي.د پریمر بانډونه باید شتون ولري، او د دوه پریمر بډونو روښانتیا باید تقریبا ورته وي.د مثال په توګه، یو پریمر یو بانډ لري او بل پریمر هیڅ بانډ نلري.د پټو لپاره، PCR ممکن پدې وخت کې ناکام شي او باید د پریمر ترکیب واحد سره د خبرو اترو له لارې حل شي.که یو پریمر لوړ روښانتیا ولري او بل ټیټ روښانتیا ولري، د پریمرونو د کمولو په وخت کې غلظت توازن کړئ.

③ پرائمرونه باید په ډیر غلظت او لږ مقدار کې زیرمه شي ترڅو د بار بار یخیدو او پړسیدو مخه ونیول شي یا په یخچال کې د اوږدې مودې ذخیره کول ممکن د پریمرونو د خرابیدو او تخریب لامل شي.

④د پرائمر ډیزاین غیر معقول دی، لکه د پریمر اوږدوالی کافي نه دی، ډیمر د پریمرونو ترمنځ جوړیږي، او داسې نور. د Mg2+ غلظت: د Mg2+ آئن غلظت د PCR امپلیفیکیشن موثریت باندې لوی تاثیر لري.که چیرې غلظت خورا لوړ وي ، نو دا کولی شي د PCR امپلیفیکیشن ځانګړتیا کمه کړي.که چیرې غلظت خورا ټیټ وي ، نو دا به د PCR امپلیفیکیشن حاصل اغیزه وکړي او حتی د دې لامل شي چې د PCR امپلیفیکیشن د بډونو پراخولو پرته ناکام شي.د عکس العمل حجم کې بدلونونه: معمولا د PCR امپلیفیکیشن لپاره کارول شوي حجمونه 20ul، 30ul، او 50ul دي.یا 100ul، کوم حجم باید د PCR امپلیفیکیشن لپاره وکارول شي د ساینسي څیړنو او کلینیکي ازموینې مختلف اهدافو سره سم تنظیم شوي.د کوچني حجم جوړولو وروسته، لکه 20ul، او بیا لوی حجم جوړ کړئ، تاسو باید شرایط تعقیب کړئ، که نه نو دا به په اسانۍ سره ناکام شي.فزیکي لاملونه: د PCR د لوړولو لپاره د ډینیچریشن خورا مهم دی.که چیرې د تودوخې تودوخه ټیټه وي او د تخریب وخت لنډ وي، د غلط منفي پیښو احتمال ډیر دی؛د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه ده، کوم چې کولی شي د غیر مشخص پراخوالي لامل شي او د ځانګړي امپلیفیکیشن موثریت کم کړي.د انیل کولو تودوخه خورا لوړه ده.ټیمپلیټونو ته د پریمرونو پابندۍ خورا ډیر تاثیر کوي او د PCR امپلیفیکیشن موثریت کموي.ځینې ​​​​وختونه دا اړینه ده چې یو معیاري ترمامیتر وکاروئ ترڅو په امپلیفیر یا په اوبو کې محلول شوي کڅوړه کې د ډینیټوریشن ، اینیلینګ او تودوخې تودوخې معاینه کړئ.دا هم د PCR د ناکامۍ یو لامل دی.د هدف ترتیب تغیر: که د هدف ترتیب بدل شوی یا حذف شوی وي ، کوم چې د ټیمپلیټ سره د پریمر ځانګړي پابند اغیزه کوي ، یا پریمر او ټیمپلیټ د هدف ترتیب د یوې ټاکلې برخې د حذف کیدو له امله تکمیلي ترتیب له لاسه ورکوي ، د PCR امپلیفیکیشن بریالي به نشي.

2. غلط مثبت د PCR امپلیفیکیشن بانډ چې ښکاري د هدف ترتیب بانډ سره مطابقت لري، او ځینې وختونه دا بانډ ډیر منظم او روښانه وي.نامناسب پرائمر ډیزاین: ټاکل شوې امپلیفیکیشن سلسله د غیر هدف امپلیفیکیشن ترتیب سره هومولوژي لري ، نو کله چې د PCR امپلیفیکیشن ترسره کوي ، د PCR امپلیفیکیشن محصول یو غیر هدف ترتیب دی.که د هدف ترتیب ډیر لنډ وي یا پریمر ډیر لنډ وي، غلط مثبت ممکن په اسانۍ سره واقع شي.پریمر باید بیا ډیزاین شي.د هدف ترتیبونو یا امپلیفیکیشن محصولاتو کراس ککړتیا: د دې ککړتیا دوه لاملونه شتون لري: لومړی د ټول جینوم یا لویو برخو کراس ککړتیا چې د غلط مثبتو لامل کیږي.دا غلط مثبت د لاندې میتودونو په واسطه حل کیدی شي: د کار کولو په وخت کې محتاط او نرم اوسئ ترڅو د هدف ترتیب د نمونې ټوپک کې د اچولو یا د سینټرفیوج ټیوب څخه د ویشلو مخه ونیول شي.د انزایمونو او موادو پرته چې د لوړې تودوخې سره مقاومت نشي کولی، ټول ریجنټ یا تجهیزات باید د لوړ فشار په واسطه تعقیم شي.ټول سینټرفیوج ټیوبونه او د نمونې انجیکشن پایپټ لارښوونې باید یوځل وکارول شي.که اړتیا وي، د عکس العمل ټیوبونه او ریجنټونه د نمونې اضافه کولو دمخه د الټرا وایلیټ رڼا سره شعاع کیږي ترڅو موجود نیوکلیک اسیدونه له مینځه ویسي.دوهم په هوا کې د نیوکلیک اسیدونو د کوچنیو برخو ککړتیا ده.دا کوچنۍ ټوټې د هدف ترتیب څخه لنډې دي، مګر یو مشخص هومولوژي لري.دوی یو بل ته ویشل کیدی شي، او د پریمرونو بشپړولو وروسته، د PCR محصولات پراخ کیدی شي، په پایله کې غلط مثبت، کوم چې کیدای شي د پی سی آر میتودونو په واسطه کم یا له منځه یوړل شي.

 

3. غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه څرګندیږي هغه بانډونه چې د PCR امپلیفیکیشن وروسته څرګندیږي د متوقع اندازې سره متناسب دي ، یا لوی یا کوچني ، یا دواړه ځانګړي امپلیفیکیشن بانډونه او غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه په ورته وخت کې څرګندیږي.د غیر مشخص بانډونو د څرګندیدو لاملونه په لاندې ډول دي: لومړی، پریمرونه په بشپړ ډول د هدف ترتیب سره بشپړونکي ندي، یا پرائمرونه د ډیمرونو د جوړولو لپاره راټولیږي.دوهم دلیل یې دا دی چې د Mg2+ آیون غلظت خورا لوړ دی ، د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه ده ، او د PCR دورې شمیر خورا لوړ دی.دوهم فاکتور د انزایم کیفیت او مقدار دی.د ځینو سرچینو څخه انزایمونه اکثرا د غیر مشخص بانډونو سره مخ دي مګر د نورو سرچینو څخه انزایمونه ندي.د انزایمونو ډیر مقدار ځینې وختونه د غیر مشخص لوړیدو لامل کیدی شي.د مخنیوي اقداماتو کې شامل دي: د اړتیا په صورت کې پریمر بیا ډیزاین کړئ.د انزایم مقدار کم کړئ یا یې د بلې سرچینې سره بدل کړئ.د پریمرونو اندازه کمه کړئ، د نمونې اندازه په مناسبه توګه زیاته کړئ، او د سایکلونو شمیر کم کړئ.د انیل کولو تودوخه په مناسبه توګه لوړه کړئ یا د دوه تودوخې نقطې میتود وکاروئ (په 93 درجې سانتي ګراد کې ډینیټریشن ، انیل کول او د 65 درجې C شاوخوا غزول).

 

4. فلکي ډریګ یا سمیرونه د PCR امپلیفیکیشن ښکاري کله ناکله د مسیر شوي بانډونو ، د شیټ په څیر بندونو یا د غالۍ په څیر بانډونو په څیر ښکاري.لاملونه اکثرا د ډیر انزایمونو یا د انزایمونو ضعیف کیفیت ، ډیر لوړ dNTP غلظت ، ډیر لوړ Mg2 + غلظت ، د انیل کولو تودوخې خورا ټیټ ، او ډیری دورې له امله رامینځته کیږي.د مخنیوي اقداماتو کې شامل دي: ① د انزایم مقدار کم کړئ ، یا د انزایم ځای په بل ځای کې واچوئ.②د dNTP غلظت کموي.په مناسب ډول د Mg2+ غلظت کم کړئ.د ټیمپلیټ مقدار زیات کړئ او د دورې شمیر کم کړئ