PCR FAQ 1. غلط منفي، ڪوبه ايمپليفڪيشن بينڊ ظاهر نٿو ٿئي 2. غلط مثبت 3. غير مخصوص ايمپليفڪيشن بينڊ ظاهر ٿين ٿا 4. فلڪي ڊريگ اسٽريپس يا سميئر اسٽريپس ظاهر ٿين ٿا:

1 غلط ناڪاري، ڪوبه وڌايل بينڊ ظاهر نٿو ٿئي PCR ردعمل جا اهم حصا آهن

① ٽيمپليٽ نيوڪليڪ ايسڊ جي تياري

② پرائمر معيار ۽ خاصيت

③ enzyme معيار ۽

④ PCR چڪر حالتون.ان جا سبب ڳولڻ لاءِ مٿي ڏنل لنڪن تي پڻ تجزيو ۽ تحقيق ڪرڻ گهرجي.

سانچو:

① ٽيمپليٽ ۾ ناپاڪ پروٽين شامل آهن

② ٽيمپليٽ Taq enzyme inhibitors تي مشتمل آهي

③ ٽيمپليٽ ۾ موجود پروٽين کي هضم نه ڪيو ويندو آهي ۽ نه هٽايو ويندو آهي، خاص طور تي ڪروموزوم ۾ هسٽون

④ ٽيمپليٽ کي ڪڍڻ ۽ تيار ڪرڻ دوران تمام گهڻو ضايع ڪيو ويو، يا فينول کي اندر داخل ڪيو ويو

⑤ ٽيمپليٽ نيوڪليڪ ايسڊ مڪمل طور تي رد ٿيل نه آهي.جڏهن اينزائمز ۽ پرائمر جو معيار سٺو آهي، جيڪڏهن ايمپليفڪيشن بينڊ ظاهر نه ٿيندا آهن، گهڻو ڪري اهو ممڪن آهي ته نموني جي هضمي جي عمل يا ٽيمپليٽ نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ واري عمل ۾ ڪجهه غلط آهي.تنهن ڪري، هڪ مؤثر ۽ مستحڪم هضم حل تيار ڪيو وڃي، ۽ طريقيڪار کي مقرر ڪيو وڃي ۽ پنهنجي مرضي تي تبديل نه ڪيو وڃي..اينزيم غير فعال ٿيڻ: اهو ضروري آهي ته نئين اينزائيم کي تبديل ڪرڻ، يا هڪ ئي وقت تي پراڻي ۽ نئين اينزيميمس ٻنهي کي استعمال ڪرڻ جو تجزيو ڪرڻ لاء ته ڇا غلط منفيات نقصان يا ناکافي اينزائم سرگرمي جي سبب آهن.اهو ياد رکڻ گهرجي ته ڪڏهن ڪڏهن ٽاڪ اينزيم کي وساريو ويندو آهي. پرائمر: پرائمر معيار، پرائمر ڪنسنٽريشن، ۽ ڇا ٻن پرائمر جي ڪنسنٽريشن هڪجهڙائي آهي PCR ناڪامي يا غير اطمينان بخش ايمپليفڪيشن بينڊز ۽ آسان ڦهلائڻ جا عام سبب آهن.ڪجھ بيچن ۾ پرائمر سنٿيسس جي معيار سان مسئلا آھن.ٻن پرائمر مان ھڪڙو ھڪڙو اعلي ڪنسنٽريشن آھي ۽ ٻئي ۾ گھٽ ڪنسنٽريشن آھي، جنھن جي نتيجي ۾ گھٽ ڪارڪردگيءَ جي برابري واري ايمپليڪشن آھي.

انسدادي طريقا هي آهن:

① هڪ سٺو پرائمر سنٿيسس يونٽ چونڊيو.

② پرائمر جي ڪنسنٽريشن کي نه رڳو او ڊي جي قيمت کي ڏسڻ گهرجي، پر ايگرز جيل الیکٹروفورسس لاءِ پرائمر اسٽاڪ حل تي به ڌيان ڏيڻ گهرجي.اتي پرائمر بينڊ ضرور ھئڻ گھرجي، ۽ ٻن پرائمر بينڊن جي چمڪ لڳ ڀڳ ساڳي ھجڻ گھرجي.مثال طور، هڪ پرائمر وٽ بينڊ آهي ۽ ٻئي پرائمر وٽ بينڊ ناهي.پٽي لاء، PCR هن وقت ناڪام ٿي سگهي ٿو ۽ پرائمر سنٿيسس يونٽ سان ڳالهين ذريعي حل ڪيو وڃي.جيڪڏهن هڪ پرائمر ۾ وڌيڪ روشني آهي ۽ ٻئي ۾ گهٽ روشني آهي، پرائمر کي گھٽائڻ وقت ڪنسنٽريشن کي متوازن ڪريو.

③ پرائمر کي وڌيڪ ڪنسنٽريشن ۽ ننڍي مقدار ۾ ذخيرو ڪرڻ گهرجي ته جيئن بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ يا فرج ۾ ڊگھي مدي تائين اسٽوريج کي روڪيو وڃي، جيڪو پرائمر جي خراب ٿيڻ ۽ خراب ٿيڻ جو سبب بڻجي سگهي ٿو.

④پرائمر ڊيزائن غير معقول آھي، جيئن ته پرائمر جي ڊگھائي ڪافي نه آھي، پرائمر جي وچ ۾ ڊائمر ٺھيل آھن، وغيره. Mg2+ ڪنسنٽريشن: Mg2+ آئن ڪنسنٽريشن جو PCR amplification ڪارڪردگي تي وڏو اثر آھي.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهڻي آهي، اهو PCR امپليڪشن جي خاصيت کي گهٽائي سگهي ٿو.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، اهو PCR امپليفڪيشن جي پيداوار تي اثرانداز ٿيندو ۽ ايستائين جو PCR امپليفڪيشن کي بينڊ وڌائڻ کان سواءِ ناڪام ٿيندو.رد عمل جي مقدار ۾ تبديليون: عام طور تي پي سي آر ايمپليفڪيشن لاءِ استعمال ٿيندڙ حجم 20ul، 30ul، ۽ 50ul آهن.يا 100ul، PCR amplification لاءِ ڪهڙي مقدار کي استعمال ڪرڻ گهرجي سائنسي تحقيق ۽ ڪلينڪل ٽيسٽ جي مختلف مقصدن جي مطابق مقرر ڪيو ويو آهي.ننڍو حجم ٺاهڻ کان پوء، جهڙوڪ 20ul، ۽ پوء وڏو حجم ٺاهڻ، توهان کي شرطن جي پيروي ڪرڻ گهرجي، ٻي صورت ۾ اهو آسانيء سان ناڪام ٿيندو.جسماني سبب: پي سي آر ايمپليفڪيشن لاءِ ڊينيچريشن تمام ضروري آهي.جيڪڏهن denaturation گرمي پد گهٽ آهي ۽ denaturation جو وقت ننڍو آهي، غلط منفي واقعا تمام گهڻو امڪان آهن؛annealing گرمي پد تمام گهٽ آهي، جنهن کي غير مخصوص amplification سبب ڪري سگهو ٿا ۽ مخصوص amplification ڪارڪردگي کي گھٽائي.annealing گرمي پد تمام بلند آهي.پرائمر کي ٽيمپليٽس جي پابند کي تمام گهڻو متاثر ڪري ٿو ۽ پي سي آر امپليڪشن ڪارڪردگي کي گھٽائي ٿو.ڪڏهن ڪڏهن اهو ضروري آهي ته هڪ معياري ٿرماميٽر استعمال ڪيو وڃي ته ڊينيچريشن، اينيلنگ ۽ ايڪسٽينشن جي گرمي پد کي جانچڻ لاءِ ايمپليفائر يا پاڻي ۾ حل ٿيندڙ برتن ۾.اهو پڻ PCR جي ناڪامي جو هڪ سبب آهي.ھدف جي ترتيب ۾ تبديلي: جيڪڏھن ھدف جي ترتيب کي ميوٽيٽ ڪيو وڃي يا ختم ڪيو وڃي، جيڪو ٽيمپليٽ تي پرائمر جي مخصوص بائنڊنگ کي متاثر ڪري ٿو، يا پرائمر ۽ ٽيمپليٽ کي ھدف جي ترتيب جي ھڪڙي خاص حصي کي ختم ڪرڻ جي ڪري مڪمل ڪرڻ واري ترتيب کي وڃائي ٿو، پي سي آر ايمپليفڪيشن ڪامياب نه ٿيندو.

2. غلط مثبت PCR ايمپليفڪيشن بينڊ جيڪو ظاهر ٿئي ٿو اهو ٽارگيٽ ترتيب واري بينڊ سان هڪجهڙائي رکي ٿو، ۽ ڪڏهن ڪڏهن بينڊ وڌيڪ منظم ۽ روشن هوندو آهي.نامناسب پرائمر ڊيزائن: چونڊيل ايمپليفڪيشن تسلسل غير ٽارگيٽ ايمپليفڪيشن تسلسل سان هومولوجي آهي، تنهن ڪري جڏهن پي سي آر ايمپليفڪيشن کي انجام ڏيو ٿا، پي سي آر پراڊڪٽ هڪ غير ٽارگيٽ ترتيب آهي.جيڪڏهن حدف جو سلسلو تمام ننڍو آهي يا پرائمر تمام ننڍو آهي، غلط مثبت آساني سان ٿي سگهي ٿو.پرائمر کي ٻيهر ڊزائين ڪرڻ جي ضرورت آهي.ھدف جي ترتيبن يا ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس جي پار آلودگي: ھن آلودگي جا ٻه سبب آھن: پهريون، سڄي جينوم يا وڏن ٽڪرن جو پار آلودگي، غلط مثبتات جي ڪري.ھن غلط مثبت کي ھيٺين طريقن سان حل ڪري سگھجي ٿو: ھدف جي ترتيب کي نموني گن ۾ داخل ٿيڻ يا سينٽريفيوج ٽيوب مان ٻاھر نڪرڻ کان روڪڻ لاءِ آپريشن ڪرڻ وقت محتاط ۽ نرم رھو.سواءِ انزايمز ۽ مادين جي جيڪي تيز گرمي پد کي برداشت نه ڪري سگھن ٿيون، سڀني ريجنٽس يا سامان کي تيز دٻاءَ سان جراثيم کان پاڪ ڪيو وڃي.سڀ سينٽريفيوج ٽيوب ۽ نموني انجيڪشن پائيپ ٽائيپ کي هڪ ڀيرو استعمال ڪيو وڃي.جيڪڏهن ضروري هجي ته، رد عمل واري ٽيوب ۽ ريجنٽس کي الٽرا وائلٽ روشني سان شعاع ڪيو ويندو آهي، نموني شامل ڪرڻ کان اڳ موجود نيوڪليڪ ايسڊ کي تباهه ڪرڻ لاء.ٻيو ته هوا ۾ نيوڪليڪ اسيد جي ننڍن ٽڪرن جي آلودگي آهي.اهي ننڍا ٽڪرا حدف جي ترتيب کان ننڍا آهن، پر ڪجهه مخصوص هومولوجي آهن.انهن کي هڪ ٻئي سان ورهائي سگهجي ٿو، ۽ پرائمر جي مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، پي سي آر پروڊڪٽس کي وڌايو وڃي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ غلط مثبت نتيجا پيدا ٿين ٿا، جن کي پي سي آر طريقن سان گهٽائي يا ختم ڪري سگهجي ٿو.

 

3. غير مخصوص ايمپليفڪيشن بينڊ ظاهر ٿيندا آهن جيڪي بينڊ PCR ايمپليفڪيشن کان پوءِ ظاهر ٿيندا آهن اهي متوقع سائيز سان متضاد هوندا آهن، يا ته وڏا يا ننڍا، يا ٻئي مخصوص ايمپليفڪيشن بينڊ ۽ غير مخصوص ايمپليفڪيشن بينڊ هڪ ئي وقت ظاهر ٿيندا آهن.غير مخصوص بئنڊز جي ظاهر ٿيڻ جا سبب هي آهن: پهريون، پرائمر مڪمل طور تي حدف جي ترتيب سان مڪمل طور تي مڪمل نه هوندا آهن، يا پرائمر مجموعي طور تي ڊيمر ٺاهيندا آهن.ٻيو سبب اهو آهي ته Mg2+ آئن ڪنسنٽريشن تمام گهڻو آهي، انيلنگ جي درجه حرارت تمام گهٽ آهي، ۽ PCR سائيڪلن جو تعداد تمام گهڻو آهي.ٻيو عنصر اينزيم جي معيار ۽ مقدار آهي.ڪجھ ذريعن مان اينزائمز اڪثر ڪري غير مخصوص بينڊن جو شڪار آھن پر ٻين ذريعن کان اينزائمز نه آھن.انزايمز جي گهڻي مقدار ڪڏهن ڪڏهن غير مخصوص امپلائيشن جي ڪري سگھي ٿي.جوابي قدمن ۾ شامل آهن: جيڪڏهن ضروري هجي ته پرائمر کي ٻيهر ترتيب ڏيو.اينزيم جي مقدار کي گھٽايو يا ان کي ٻئي ذريعن سان تبديل ڪريو.پرائمر جي مقدار کي گھٽايو، ٽيمپليٽ جي مقدار کي مناسب طور تي وڌايو، ۽ چڪر جو تعداد گھٽايو.مناسب طور تي اينيلنگ جي درجه حرارت کي وڌايو يا ٻه-درجه حرارت واري پوائنٽ جو طريقو استعمال ڪريو (93 ° C تي، annealing ۽ ايڪسٽينشن 65 ° C جي چوڌاري).

 

4. فلڪي ڊريگ يا سميئر ظاهر ٿيندا آهن PCR ايمپليفڪيشن ڪڏهن ڪڏهن smeared بينڊ، شيٽ جهڙو بينڊ يا قالين جهڙو بينڊ.ان جا سبب اڪثر انزائم جي تمام گھڻي يا خراب معيار، تمام گھڻو dNTP ڪنسنٽريشن، تمام گھڻو Mg2+ ڪنسنٽريشن، تمام گھٽ اينيلنگ گرمي پد، ۽ تمام گھڻا چڪر آھن.جوابي قدمن ۾ شامل آهن: ① انزائم جي مقدار کي گھٽائڻ، يا انزائيم کي ٻئي ذريعن سان تبديل ڪريو.②DNTP جي ڪنسنٽريشن کي گھٽايو.مناسب طور تي Mg2+ ڪنسنٽريشن کي گھٽايو.ٽيمپليٽ جي مقدار کي وڌايو ۽ چڪر جو تعداد گھٽايو