PCR නිති අසන පැන 1. ව්යාජ සෘණාත්මක, විස්තාරණ කලාපයක් නොපෙනේ
1අසත්‍ය සෘණ, වර්ධක කලාපයක් නොපෙනේ PCR ප්‍රතික්‍රියාවේ ප්‍රධාන අංග වේ
① සැකිල්ල නියුක්ලෙයික් අම්ලය සකස් කිරීම
② ප්‍රාථමිකයේ ගුණාත්මකභාවය සහ විශේෂත්වය
③ එන්සයිම ගුණාත්මකභාවය සහ
④ PCR චක්‍ර කොන්දේසි.හේතු සොයා ගැනීම සඳහා, ඉහත සබැඳි මත විශ්ලේෂණය සහ පර්යේෂණ ද පැවැත්විය යුතුය.
සැකිල්ල:
① සැකිල්ලේ අපිරිසිදු ප්‍රෝටීන අඩංගු වේ
② සැකිල්ලේ Taq එන්සයිම නිෂේධක අඩංගු වේ
③ සැකිල්ලේ ඇති ප්‍රෝටීන දිරවා ඉවත් නොකෙරේ, විශේෂයෙන් වර්ණදේහවල ඇති හිස්ටෝන
④ අච්චුව නිස්සාරණය කිරීමේදී සහ සකස් කිරීමේදී ඕනෑවට වඩා නැති විය, නැතහොත් ෆීනෝල් ආශ්වාස කරන ලදී
⑤නියුක්ලෙයික් අම්ලය සැකිල්ල සම්පූර්ණයෙන් ඉවත් කර නැත.එන්සයිම සහ ප්‍රයිමර් වල ගුණාත්මක භාවය යහපත් වන විට, විස්තාරණ පටි නොපෙනේ නම්, එය බොහෝ විට නියැදියේ දිරවීමේ ක්‍රියාවලියේ හෝ සැකිල්ල න්යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණ ක්‍රියාවලියේ යම් දෝෂයක් ඇති බව පෙනේ.එබැවින්, ඵලදායී හා ස්ථායී ආහාර දිරවීමේ විසඳුමක් සකස් කළ යුතු අතර, ක්රියා පටිපාටිය සවි කළ යුතු අතර කැමැත්තෙන් වෙනස් නොකළ යුතුය..එන්සයිම අක්‍රිය වීම: නව එන්සයිම ප්රතිස්ථාපනය කිරීම හෝ පැරණි සහ නව එන්සයිම යන දෙකම එකවර භාවිතා කිරීම අවශ්‍ය වේ, ව්යාජ සෘණ ඇති වන්නේ නැතිවීම හෝ ප්‍රමාණවත් නොවන එන්සයිම ක්‍රියාකාරිත්වය නිසාද යන්න විශ්ලේෂණය කිරීම.සමහර විට Taq එන්සයිම අමතක වී ඇති බව සැලකිල්ලට ගත යුතුය.Primers: Primer ගුණාත්මක භාවය, ප්‍රාථමික සාන්ද්‍රණය සහ ප්‍රයිමර් දෙකේ සාන්ද්‍රණය සමමිතිකද යන්න PCR අසාර්ථක වීමට හෝ අසතුටුදායක විස්තාරණ පටි සහ පහසු විසරණයට පොදු හේතු වේ.සමහර කාණ්ඩවල ප්‍රාථමික සංස්ලේෂණයේ ගුණාත්මකභාවය පිළිබඳ ගැටළු තිබේ.ප්‍රයිමර් දෙකෙන් එකක් ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් යුක්ත වන අතර අනෙක අඩු සාන්ද්‍රණයකින් යුක්ත වන අතර එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස අඩු කාර්යක්ෂම අසමමිතික විස්තාරණයක් ඇති වේ.
ප්රතිවිරෝධතා වන්නේ:
① හොඳ ප්‍රයිමර් සංස්ලේෂණ ඒකකයක් තෝරන්න.
② ප්‍රයිමර්වල සාන්ද්‍රණය OD අගය දෙස පමණක් නොව, ඇගරෝස් ජෙල් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරේසිස් සඳහා ප්‍රාථමික කොටස් ද්‍රාවණය කෙරෙහි ද අවධානය යොමු කළ යුතුය.ප්‍රයිමර් බෑන්ඩ් තිබිය යුතු අතර ප්‍රයිමර් බෑන්ඩ් දෙකේ දීප්තිය දළ වශයෙන් සමාන විය යුතුය.උදාහරණයක් ලෙස, එක් ප්‍රයිමරයක පටියක් ඇති අතර අනෙක් ප්‍රයිමරයට පටියක් නොමැත.තීරු සඳහා, මෙම අවස්ථාවේදී PCR අසමත් විය හැකි අතර ප්‍රාථමික සංස්ලේෂණ ඒකකය සමඟ සාකච්ඡා කිරීමෙන් විසඳා ගත යුතුය.එක් ප්‍රයිමරයක් ඉහළ දීප්තියකින් සහ අනෙකෙහි දීප්තිය අඩු නම්, ප්‍රයිමර් තනුක කිරීමේදී සාන්ද්‍රණය සමතුලිත කරන්න.
③ ප්‍රයිමර් නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම හෝ ශීතකරණය තුළ දිගු කාලීන ගබඩා කිරීම වැළැක්වීම සඳහා ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් සහ කුඩා ප්‍රමාණවලින් ගබඩා කළ යුතු අතර එමඟින් ප්‍රයිමර් නරක් වීමට හා ක්ෂය වීමට හේතු විය හැක.
④ ප්‍රාථමිකයේ දිග ප්‍රමාණවත් නොවීම, ප්‍රයිමර් අතර ඩයිමර් සෑදී ඇත, යනාදී ලෙස ප්‍රයිමර් සැලසුම අසාධාරණ ය.සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ නම්, එය PCR විස්තාරණයේ විශේෂත්වය අඩු කළ හැකිය.සාන්ද්‍රණය ඉතා අඩු නම්, එය PCR වර්ධක අස්වැන්නට බලපාන අතර කලාප විස්තාරණය නොකර PCR විස්තාරණය අසාර්ථක වීමට පවා හේතු වේ.ප්‍රතික්‍රියා පරිමාවේ වෙනස්වීම්: සාමාන්‍යයෙන් PCR විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කරන වෙළුම් 20ul, 30ul සහ 50ul වේ.හෝ 100ul, PCR විස්තාරණය සඳහා භාවිතා කළ යුතු පරිමාව විද්‍යාත්මක පර්යේෂණ සහ සායනික පරීක්ෂණවල විවිධ අරමුණු අනුව සකසා ඇත.20ul වැනි කුඩා පරිමාවක් සාදා, පසුව විශාල පරිමාවක් සෑදීමෙන් පසු, ඔබ කොන්දේසි අනුගමනය කළ යුතුය, එසේ නොමැතිනම් එය පහසුවෙන් අසමත් වනු ඇත.භෞතික හේතූන්: PCR විස්තාරණය සඳහා Denaturation ඉතා වැදගත් වේ.denaturation උෂ්ණත්වය අඩු නම් සහ denaturation කාලය කෙටි නම්, ව්යාජ සෘණ ඇතිවීමට බොහෝ දුරට ඉඩ ඇත;ඇනීලිං උෂ්ණත්වය ඉතා අඩු වන අතර, එය විශේෂිත නොවන විස්තාරණයක් ඇති කළ හැකි අතර නිශ්චිත විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව අඩු කරයි.නිර්වින්දන උෂ්ණත්වය ඉතා ඉහළ ය.අච්චු වලට ප්‍රයිමර් බන්ධනයට බෙහෙවින් බලපාන අතර PCR විස්තාරණ කාර්යක්ෂමතාව අඩු කරයි.සමහර විට ඇම්ප්ලිෆයර් හෝ ජල-ද්‍රාව්‍ය බඳුනේ ඩීනාටරේෂන්, ඇනීලිං සහ දිගු උෂ්ණත්වය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා සම්මත උෂ්ණත්වමානයක් භාවිතා කිරීම අවශ්‍ය වේ.PCR අසාර්ථක වීමට මෙයද එක් හේතුවකි.ඉලක්ක අනුක්‍රමික විචලනය: ඉලක්ක අනුපිළිවෙල විකෘති වී හෝ මකා දැමුවහොත්, එය අච්චුව වෙත ප්‍රාථමිකයේ නිශ්චිත බන්ධනයට බලපාන්නේ නම්, හෝ ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි යම් කොටසක් මකා දැමීම හේතුවෙන් ප්‍රාථමිකය සහ අච්චුව අනුපූරක අනුපිළිවෙල අහිමි වුවහොත්, PCR විස්තාරණය සාර්ථක නොවනු ඇත.
2.false පොසිටිව් දිස්වන PCR විස්තාරණ කලාපය ඉලක්ක අනුක්‍රමික කලාපයට අනුකූල වන අතර සමහර විට කලාපය වඩාත් පිළිවෙලට සහ දීප්තිමත් වේ.නුසුදුසු ප්‍රාථමික සැලසුම: තෝරාගත් විස්තාරණ අනුපිළිවෙලට ඉලක්ක නොවන විස්තාරණ අනුපිළිවෙල සමඟ සමජාතීය ඇත, එබැවින් PCR විස්තාරණය සිදු කරන විට, විස්තාරණය කරන ලද PCR නිෂ්පාදනය ඉලක්ක නොවන අනුපිළිවෙලකි.ඉලක්ක අනුපිළිවෙල ඉතා කෙටි නම් හෝ ප්‍රාථමිකය ඉතා කෙටි නම්, ව්යාජ ධනාත්මක පහසුවෙන් සිදු විය හැක.ප්‍රයිමර් නැවත සැලසුම් කළ යුතුයි.ඉලක්ක අනුපිළිවෙලෙහි හරස් දූෂණය හෝ විස්තාරණ නිෂ්පාදන: මෙම දූෂණයට හේතු දෙකක් තිබේ: පළමුව, සම්පූර්ණ ජෙනෝමය හෝ විශාල කොටස්වල හරස් දූෂණය, ව්යාජ ධනාත්මක බවට හේතු වේ.මෙම ව්යාජ ධනාත්මක බව පහත ක්‍රම මගින් විසඳිය හැක: ඉලක්ක අනුපිළිවෙල නියැදි තුවක්කුව තුලට උරාබීම හෝ කේන්ද්රාපසාරී නලයෙන් ඉවතට විසිවීම වැලැක්වීමට ක්රියා කිරීමේදී ප්‍රවේශම් සහ මෘදු වන්න.අධික උෂ්ණත්වයට ඔරොත්තු නොදෙන එන්සයිම සහ ද්‍රව්‍ය හැර, සියලුම ප්‍රතික්‍රියාකාරක හෝ උපකරණ අධි පීඩනයකින් විෂබීජහරණය කළ යුතුය.සියලුම කේන්ද්රාපසාරී නල සහ නියැදි එන්නත් පයිප්ප ඉඟි එක් වරක් භාවිතා කළ යුතුය.අවශ්‍ය නම්, පවතින න්යෂ්ටික අම්ල විනාශ කිරීම සඳහා නියැදිය එකතු කිරීමට පෙර ප්‍රතික්‍රියා නල සහ ප්‍රතික්‍රියාකාරක පාරජම්බුල කිරණවලින් විකිරණය කරනු ලැබේ.දෙවැන්න වාතයේ ඇති න්යෂ්ටික අම්ලවල කුඩා කොටස් දූෂණය වීමයි.මෙම කුඩා කොටස් ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට වඩා කෙටි වන නමුත් නිශ්චිත සමජාතීයතාවයක් ඇත.ඒවා එකිනෙකට බෙදිය හැකි අතර, ප්‍රයිමර්වලට අනුපූරක වූ පසු, PCR නිෂ්පාදන විස්තාරණය කළ හැකි අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ව්යාජ ධනාත්මක තත්ත්වයන් ඇති විය හැකි අතර, එය කැදලි PCR ක්‍රම මගින් අඩු කිරීමට හෝ ඉවත් කිරීමට හැකිය.
3.Non-specific ampplification bands පෙනී යයි PCR වර්ධකයෙන් පසු දිස්වන පටි විශාල හෝ කුඩා අපේක්ෂිත ප්‍රමාණයට නොගැලපේ, නැතහොත් විශේෂිත විස්තාරණ කලාප සහ විශේෂිත නොවන විස්තාරණ කලාප දෙකම එකවර දිස්වේ.විශේෂිත නොවන කලාපවල පෙනුම සඳහා හේතු වනුයේ: පළමුව, ප්‍රාථමිකයන් ඉලක්ක අනුපිළිවෙලට සම්පූර්ණයෙන්ම අනුපූරක නොවේ, නැතහොත් ප්‍රයිමර් එකතු වී ඩිමර් සෑදේ.දෙවන හේතුව නම් Mg2+ අයන සාන්ද්‍රණය ඉතා ඉහළ වීම, ඇනීලිං උෂ්ණත්වය ඉතා අඩු වීම සහ PCR චක්‍ර ගණන ඉතා ඉහළ වීමයි.දෙවන සාධකය වන්නේ එන්සයිමයේ ගුණාත්මකභාවය සහ ප්රමාණයයි.සමහර ප්‍රභවයන්ගෙන් එන එන්සයිම බොහෝ විට විශේෂිත නොවන කලාපවලට නැඹුරු වන නමුත් වෙනත් ප්‍රභවයන්ගෙන් එන්සයිම එසේ නොවේ.එන්සයිමවල අධික ප්රමාණය සමහර විට නිශ්චිත නොවන විස්තාරණයකට හේතු විය හැක.ප්‍රතිවිරෝධතාවලට ඇතුළත් වන්නේ: අවශ්‍ය නම් ප්‍රයිමර් නැවත සැලසුම් කරන්න.එන්සයිම ප්රමාණය අඩු කිරීම හෝ වෙනත් ප්රභවයක් සමඟ එය ප්රතිස්ථාපනය කරන්න.ප්‍රයිමර් ප්රමාණය අඩු කරන්න, අච්චු ප්රමාණය සුදුසු ලෙස වැඩි කරන්න, සහ චක්‍ර ගණන අඩු කරන්න.යෝග්‍ය ලෙස ඇනීලිං උෂ්ණත්වය වැඩි කරන්න හෝ ද්වි-උෂ්ණත්ව ලක්ෂ්‍ය ක්‍රමය භාවිතා කරන්න (93°C දී denaturation, annealing and extension about 65°C).
4. Flaky drag හෝ smears දිස්වේ PCR විස්තාරණය සමහර විට ආලේප කරන ලද පටි, පත්‍ර වැනි පටි හෝ කාපට් වැනි පටි ලෙස දිස් වේ.හේතූන් බොහෝ විට හේතු වන්නේ එන්සයිමයේ අධික එන්සයිම හෝ දුර්වල ගුණාත්මක එන්සයිම, අධික dNTP සාන්ද්‍රණය, අධික Mg2+ සාන්ද්‍රණය, ඉතා අඩු උෂ්ණාධික උෂ්ණත්වය සහ බොහෝ චක්‍ර ය.ප්‍රතිවිරෝධතාවලට ඇතුළත් වන්නේ: ① එන්සයිම ප්රමාණය අඩු කිරීම හෝ එන්සයිම වෙනත් ප්රභවයක් සමඟ ප්රතිස්ථාපනය කිරීම.②dNTP සාන්ද්‍රණය අඩු කරන්න.Mg2+ සාන්ද්‍රණය සුදුසු ලෙස අඩු කරන්න.සැකිලි ප්රමාණය වැඩි කර චක්‍ර ගණන අඩු කරන්න