Pogosta vprašanja o PCR 1. Lažno negativen, pomnoževalni pas se ne prikaže 2. Lažno pozitiven 3. Pojavijo se nespecifični pomnoževalni trakovi 4. Pojavijo se luskasti vlečni trakovi ali razmazni trakovi：
1Lažno negativen, pomnožen pas se ne pojavi. Ključni vidiki reakcije PCR so
① priprava šablonske nukleinske kisline
② kakovost in specifičnost primerja
③ kakovost encima in
④ Pogoji cikla PCR.Za iskanje vzrokov je treba analizo in raziskavo opraviti tudi na zgornjih povezavah.
Predloga:
① Predloga vsebuje beljakovine nečistoč
② Predloga vsebuje zaviralce encima Taq
③ Proteini v predlogi se ne prebavijo in odstranijo, zlasti histoni v kromosomih
④ Med ekstrakcijo in pripravo predloge se je izgubilo preveč ali pa je bil fenol vdihnjen
⑤Vzorčna nukleinska kislina ni popolnoma denaturirana.Če je kakovost encimov in primerjev dobra in se pomnoževalni pasovi ne pojavijo, je najverjetneje nekaj narobe s postopkom prebave vzorca ali postopkom ekstrakcije matrične nukleinske kisline.Zato je treba pripraviti učinkovito in stabilno raztopino za prebavo, postopek pa mora biti fiksen in se ga ne sme poljubno spreminjati..Inaktivacija encima: Za analizo, ali so lažni negativni rezultati posledica izgube ali nezadostne aktivnosti encima, je treba zamenjati nov encim ali uporabiti stare in nove encime hkrati.Upoštevati je treba, da je včasih encim Taq pozabljen. Primerji: Kakovost primerjev, koncentracija primerjev in ali sta koncentraciji obeh primerjev simetrični so pogosti razlogi za neuspeh PCR ali nezadovoljive pasove pomnoževanja in enostavno difuzijo.V nekaterih serijah so težave s kakovostjo sinteze primerja.Eden od obeh primerjev ima visoko koncentracijo, drugi pa nizko koncentracijo, kar ima za posledico nizko učinkovito asimetrično pomnoževanje.
Protiukrepi so:
① Izberite dobro enoto za sintezo primerja.
② Koncentracija primerjev ne sme upoštevati samo vrednosti OD, temveč bodite pozorni tudi na osnovno raztopino primerjev za elektroforezo v agaroznem gelu.Prisotni morajo biti trakovi temeljnega premaza, svetlost obeh trakov temeljnega premaza pa mora biti približno enaka.En temeljni premaz ima na primer trak, drugi pa brez traku.Pri trakovih lahko PCR trenutno ne uspe in ga je treba rešiti s pogajanji z enoto za sintezo primerjev.Če ima en primer visoko svetilnost in drugi nizko svetlost, uravnotežite koncentracije pri redčenju primerjev.
③ Primerje je treba shranjevati v visoki koncentraciji in majhnih količinah, da preprečite ponavljajoče se zamrzovanje in odmrzovanje ali dolgoročno shranjevanje v hladilniku, kar lahko povzroči poslabšanje in degradacijo temeljnih premazov.
④Zasnova primerja je nerazumna, na primer dolžina primerja ni dovolj, med primerji se tvorijo dimeri itd. Koncentracija Mg2+: koncentracija ionov Mg2+ ima velik vpliv na učinkovitost pomnoževanja PCR.Če je koncentracija previsoka, lahko zmanjša specifičnost pomnoževanja PCR.Če je koncentracija prenizka, bo to vplivalo na izkoristek pomnoževanja PCR in celo povzročilo neuspeh pomnoževanja PCR brez pomnoževanja trakov.Spremembe reakcijskega volumna: Običajno so volumni, uporabljeni za pomnoževanje PCR, 20 ul, 30 ul in 50 ul.Ali 100 ul, kolikšen volumen je treba uporabiti za pomnoževanje PCR, se določi glede na različne namene znanstvenih raziskav in kliničnega testiranja.Ko naredite majhno prostornino, kot je 20 ul, in nato naredite večjo prostornino, morate upoštevati pogoje, sicer bo zlahka spodletelo.Fizični razlogi: Denaturacija je zelo pomembna za PCR pomnoževanje.Če je temperatura denaturacije nizka in je čas denaturacije kratek, je zelo verjetno, da pride do lažno negativnih rezultatov;temperatura žarjenja je prenizka, kar lahko povzroči nespecifično ojačanje in zmanjša učinkovitost specifičnega ojačanja.Temperatura žarjenja je previsoka.Močno vpliva na vezavo primerjev na matrice in zmanjša učinkovitost PCR pomnoževanja.Včasih je treba uporabiti standardni termometer za preverjanje temperatur denaturacije, žarjenja in podaljšanja v ojačevalniku ali vodotopnem loncu.To je tudi eden od razlogov za neuspeh PCR.Variacija tarčnega zaporedja: Če je tarčno zaporedje mutirano ali izbrisano, kar vpliva na specifično vezavo primerja na matrico, ali če oligonukleocita in matrica izgubita komplementarno zaporedje zaradi delecije določenega segmenta tarčnega zaporedja, pomnoževanje PCR ne bo uspešen.
2. lažno pozitiven PCR pomnoževalni pas, ki se pojavi, je skladen s pasom ciljnega zaporedja in včasih je pas bolj urejen in svetlejši.Neustrezna zasnova primerja: izbrano pomnoževalno zaporedje je homologno z neciljnim pomnoževalnim zaporedjem, zato je pri izvajanju PCR pomnoževanja pomnoženi produkt PCR neciljno zaporedje.Če je ciljno zaporedje prekratko ali primer prekratek, lahko zlahka pride do lažno pozitivnih rezultatov.Primerje je treba preoblikovati.Navzkrižna kontaminacija ciljnih sekvenc ali produktov pomnoževanja: Obstajata dva razloga za to kontaminacijo: Prvič, navzkrižna kontaminacija celotnega genoma ali velikih fragmentov, kar povzroči lažno pozitivne rezultate.Ta lažno pozitiven rezultat je mogoče rešiti z naslednjimi metodami: Bodite previdni in nežni pri delu, da preprečite, da bi se ciljno zaporedje posrkalo v pištolo za vzorčenje ali brizgalo iz centrifugalne epruvete.Razen encimov in snovi, ki ne prenesejo visokih temperatur, je treba vse reagente ali opremo sterilizirati pod visokim pritiskom.Vse centrifugalne epruvete in konice pipet za vbrizgavanje vzorcev je treba uporabiti enkrat.Po potrebi se reakcijske epruvete in reagenti obsevajo z ultravijolično svetlobo, preden se doda vzorec, da se uničijo prisotne nukleinske kisline.Druga je kontaminacija majhnih fragmentov nukleinskih kislin v zraku.Ti majhni fragmenti so krajši od ciljnega zaporedja, vendar imajo določeno homologijo.Lahko se spojijo drug z drugim in potem ko so komplementarni s primerji, se produkti PCR lahko pomnožijo, kar povzroči lažno pozitivne rezultate, ki jih je mogoče zmanjšati ali odpraviti z metodami ugnezdene PCR.
3. Pojavijo se pasovi nespecifičnega pomnoževanja Trakovi, ki se pojavijo po PCR pomnoževanju, niso skladni s pričakovano velikostjo, večji ali manjši ali pa se istočasno pojavijo pasovi specifičnega pomnoževanja in nespecifični pasovi pomnoževanja.Razlogi za pojav nespecifičnih trakov so: prvič, primerji niso popolnoma komplementarni ciljnemu zaporedju ali pa se začetniki združujejo in tvorijo dimerje.Drugi razlog je previsoka koncentracija ionov Mg2+, prenizka temperatura žarjenja in previsoko število ciklov PCR.Drugi dejavnik je kakovost in količina encima.Encimi iz nekaterih virov so pogosto nagnjeni k nespecifičnim pasovom, encimi iz drugih virov pa ne.Prekomerne količine encimov lahko včasih povzročijo nespecifično ojačanje.Protiukrepi vključujejo: po potrebi preoblikovanje temeljnih premazov.Zmanjšajte količino encima ali ga nadomestite z drugim virom.Zmanjšajte količino primerjev, ustrezno povečajte količino predloge in zmanjšajte število ciklov.Ustrezno zvišajte temperaturo žarjenja ali uporabite metodo dveh temperaturnih točk (denaturacija pri 93 °C, žarjenje in podaljšanje okoli 65 °C).
4. Pojavi se kosmičasto vlečenje ali madeži. Pomnoževanje PCR se včasih pojavi kot razmazani trakovi, trakovi podobni listi ali trakovi podobni trakovi.Razlogi so pogosto posledica prevelike količine encima ali slabe kakovosti encima, previsoke koncentracije dNTP, previsoke koncentracije Mg2+, prenizke temperature žarjenja in preveč ciklov.Protiukrepi vključujejo: ① Zmanjšajte količino encima ali zamenjajte encim z drugim virom.②Zmanjšajte koncentracijo dNTP.Ustrezno zmanjšajte koncentracijo Mg2+.Povečajte število predlog in zmanjšajte število ciklov