ПЦР ФАК 1. Лажно негативан, не појављује се појас за појачавање 2. Лажно позитиван 3. Појављују се неспецифичне траке за појачавање 4. Појављују се љускаве траке за повлачење или размазивање:
1Лажно негативан, не појављује се појачана трака Кључни аспекти ПЦР реакције су
① припрема шаблонске нуклеинске киселине
② квалитет и специфичност прајмера
③ квалитет ензима и
④ Услови ПЦР циклуса.Да бисте пронашли разлоге, потребно је извршити анализу и истраживање на горњим линковима.
Шаблон:
① Шаблон садржи протеине нечистоће
② Шаблон садржи инхибиторе ензима Так
③ Протеини у шаблону се не варе и не уклањају, посебно хистони у хромозомима
④ Превише је изгубљено током екстракције и припреме шаблона или је фенол удахнут
⑤Нуклеинска киселина шаблона није потпуно денатурисана.Када је квалитет ензима и прајмера добар, ако се не појаве траке за амплификацију, највероватније је да нешто није у реду са процесом варења узорка или процесом екстракције шаблонске нуклеинске киселине.Због тога се мора припремити ефикасан и стабилан раствор за варење, а поступак треба поправити и не мењати по вољи..Инактивација ензима: Неопходно је заменити нови ензим, или истовремено користити и старе и нове ензиме да би се анализирало да ли су лажни негативни резултати узроковани губитком или недовољном активношћу ензима.Треба напоменути да се понекад заборавља Так ензим. Прајмери: Квалитет прајмера, концентрација прајмера и да ли су концентрације два прајмера симетричне су уобичајени разлози за неуспех ПЦР-а или незадовољавајуће траке амплификације и лаку дифузију.У неким серијама постоје проблеми са квалитетом синтезе прајмера.Један од два прајмера има високу концентрацију, а други ниску концентрацију, што доводи до нискоефикасне асиметричне амплификације.
Контрамере су:
① Изаберите добру јединицу за синтезу прајмера.
② Концентрација прајмера не треба да гледа само на вредност ОД, већ и да обрати пажњу на основни раствор прајмера за електрофорезу у агарозном гелу.Морају постојати прајмер траке, а сјај две траке прајмера треба да буде приближно исти.На пример, један прајмер има траку, а други прајмер нема траку.За траке, ПЦР може да не успе у овом тренутку и требало би да се реши кроз преговоре са јединицом за синтезу прајмера.Ако један прајмер има високу осветљеност, а други низак сјај, уравнотежите концентрације приликом разређивања прајмера.
③ Прајмере треба чувати у високој концентрацији и малим количинама како би се спречило поновљено замрзавање и одмрзавање или дуготрајно складиштење у фрижидеру, што може довести до пропадања и деградације прајмера.
④Дизајн прајмера је неразуман, као што је дужина прајмера није довољна, димери се формирају између прајмера итд. Концентрација Мг2+: Концентрација јона Мг2+ има велики утицај на ефикасност ПЦР амплификације.Ако је концентрација превисока, може смањити специфичност ПЦР амплификације.Ако је концентрација прениска, то ће утицати на принос ПЦР амплификације и чак узроковати неуспех ПЦР амплификације без појачања трака.Промене у запремини реакције: Обично су запремине које се користе за ПЦР амплификацију 20ул, 30ул и 50ул.Или 100ул, која запремина треба да се користи за ПЦР амплификацију се поставља у складу са различитим сврхама научног истраживања и клиничког тестирања.Након што направите малу запремину, као што је 20ул, а затим направите већу запремину, морате пратити услове, иначе ће лако пропасти.Физички разлози: Денатурација је веома важна за ПЦР амплификацију.Ако је температура денатурације ниска, а време денатурације кратко, врло је вероватно да ће доћи до лажних негативних резултата;температура жарења је прениска, што може изазвати неспецифично појачање и смањити ефикасност специфичног појачања.Температура жарења је превисока.Веома утиче на везивање прајмера за шаблоне и смањује ефикасност ПЦР амплификације.Понекад је потребно користити стандардни термометар за проверу температуре денатурације, жарења и проширења у појачалу или лонцу растворљивом у води.Ово је такође један од разлога неуспеха ПЦР-а.Варијација циљне секвенце: Ако је циљна секвенца мутирана или избрисана, што утиче на специфично везивање прајмера за шаблон, или прајмер и шаблон губе комплементарну секвенцу услед брисања одређеног сегмента циљне секвенце, ПЦР амплификација неће бити успешан.
2. лажно позитивна ПЦР амплификациона трака која се појављује је у складу са траком циљне секвенце, а понекад је трака уреднија и светлија.Неодговарајући дизајн прајмера: Одабрана секвенца амплификације има хомологију са секвенцом која није циљна амплификација, тако да када се спроводи ПЦР амплификација, амплификовани ПЦР производ је нециљана секвенца.Ако је циљна секвенца прекратка или је прајмер прекратак, лако може доћи до лажних позитивних резултата.Прајмере треба редизајнирати.Унакрсна контаминација циљних секвенци или продуката амплификације: Постоје два разлога за ову контаминацију: Прво, унакрсна контаминација целог генома или великих фрагмената, што доводи до лажних позитивних резултата.Овај лажни позитиван резултат се може решити следећим методама: Будите пажљиви и нежни када радите како бисте спречили да се циљна секвенца увуче у пиштољ за узорке или испрска из епрувете за центрифугу.Осим ензима и супстанци које не могу да издрже високе температуре, сви реагенси или опрема треба да се стерилишу под високим притиском.Све епрувете за центрифугирање и врхове пипете за убризгавање узорка треба користити једном.Ако је потребно, реакционе епрувете и реагенси се зраче ултраљубичастим светлом пре додавања узорка да би се уништиле присутне нуклеинске киселине.Други је контаминација малих фрагмената нуклеинских киселина у ваздуху.Ови мали фрагменти су краћи од циљне секвенце, али имају одређену хомологију.Они се могу спојити један са другим, а након што буду комплементарни прајмерима, ПЦР производи се могу појачати, што резултира лажним позитивним резултатима, који се могу смањити или елиминисати угнежђеним ПЦР методама.
3. Појављују се неспецифичне амплификационе траке Траке које се појављују након ПЦР амплификације нису у складу са очекиваном величином, било веће или мање, или се истовремено појављују и траке специфичне амплификације и неспецифичне амплификације.Разлози за појаву неспецифичних трака су: прво, прајмери нису у потпуности комплементарни циљној секвенци, или се прајмери агрегирају и формирају димере.Други разлог је тај што је концентрација јона Мг2+ превисока, температура жарења прениска, а број ПЦР циклуса превисок.Други фактор је квалитет и количина ензима.Ензими из неких извора су често склони неспецифичним тракама, али ензими из других извора не.Прекомерне количине ензима понекад могу довести до неспецифичног појачања.Противмере укључују: редизајн прајмера ако је потребно.Смањите количину ензима или га замените другим извором.Смањите количину прајмера, повећајте количину шаблона на одговарајући начин и смањите број циклуса.Повећајте температуру жарења на одговарајући начин или користите метод са две температуре (денатурација на 93°Ц, жарење и проширење око 65°Ц).
4. Појављују се љуспице или мрље. ПЦР амплификација се понекад појављује као размазане траке, траке налик на листове или траке налик на тепих.Разлози су често узроковани превише ензима или лошим квалитетом ензима, превисока концентрација дНТП, превисока концентрација Мг2+, прениска температура жарења и превише циклуса.Противмере укључују: ① Смањите количину ензима или замените ензим другим извором.②Смањите концентрацију дНТП.Одговарајуће смањити концентрацију Мг2+.Повећајте количину шаблона и смањите број циклуса