PCR FAQ 1. غلط منفی، کوئی ایمپلیفیکیشن بینڈ ظاہر نہیں ہوتا ہے 2. غلط مثبت 3. غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن بینڈ ظاہر ہوتے ہیں 4. فلکی ڈریگ سٹرپس یا سمیر سٹرپس ظاہر ہوتے ہیں：

1جھوٹا منفی، کوئی ایمپلیفائیڈ بینڈ ظاہر نہیں ہوتا ہے PCR ردعمل کے اہم پہلو ہیں۔

① ٹیمپلیٹ نیوکلک ایسڈ کی تیاری

② پرائمر معیار اور مخصوصیت

③ انزائم معیار اور

④ پی سی آر سائیکل کے حالات۔وجوہات جاننے کے لیے مندرجہ بالا لنکس پر تجزیہ اور تحقیق بھی کی جانی چاہیے۔

سانچے:

① ٹیمپلیٹ ناپاک پروٹین پر مشتمل ہے۔

② ٹیمپلیٹ میں Taq انزائم روکنے والے شامل ہیں۔

③ ٹیمپلیٹ میں موجود پروٹین ہضم نہیں ہوتے اور ہٹائے نہیں جاتے، خاص طور پر کروموسوم میں ہسٹون

④ ٹیمپلیٹ کو نکالنے اور تیار کرنے کے دوران بہت زیادہ ضائع ہو گیا تھا، یا فینول سانس لیا گیا تھا۔

⑤ ٹیمپلیٹ نیوکلک ایسڈ مکمل طور پر منحرف نہیں ہے۔جب انزائمز اور پرائمر کا معیار اچھا ہو، اگر ایمپلیفیکیشن بینڈ ظاہر نہیں ہوتے ہیں، تو زیادہ تر امکان ہے کہ نمونہ کے ہاضمے کے عمل یا ٹیمپلیٹ نیوکلک ایسڈ نکالنے کے عمل میں کچھ گڑبڑ ہے۔لہذا، ایک مؤثر اور مستحکم عمل انہضام کا حل تیار کیا جانا چاہئے، اور طریقہ کار کو طے کیا جانا چاہئے اور اپنی مرضی سے تبدیل نہیں کیا جانا چاہئے..انزائم کا غیر فعال ہونا: یہ ضروری ہے کہ نئے انزائم کو تبدیل کیا جائے، یا ایک ہی وقت میں پرانے اور نئے دونوں انزائمز کا استعمال کریں تاکہ یہ تجزیہ کیا جا سکے کہ آیا غلط منفی نقصانات یا ناکافی انزائم کی سرگرمی کی وجہ سے ہیں۔واضح رہے کہ بعض اوقات Taq انزائم کو فراموش کر دیا جاتا ہے۔ پرائمرز: پرائمر کا معیار، پرائمر کا ارتکاز، اور آیا دونوں پرائمر کی ارتکاز ہم آہنگی ہے PCR کی ناکامی یا غیر تسلی بخش ایمپلیفیکیشن بینڈز اور آسان بازی کی عام وجوہات ہیں۔کچھ بیچوں میں پرائمر کی ترکیب کے معیار کے ساتھ مسائل ہیں۔دو پرائمر میں سے ایک میں زیادہ ارتکاز ہوتا ہے اور دوسرے میں کم ارتکاز ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں کم کارکردگی غیر متناسب امپلیفیکیشن ہوتی ہے۔

انسدادی اقدامات یہ ہیں:

① ایک اچھا پرائمر سنتھیسس یونٹ منتخب کریں۔

② پرائمر کے ارتکاز کو نہ صرف OD قدر کو دیکھنا چاہیے بلکہ ایگرز جیل الیکٹروفورسس کے لیے پرائمر اسٹاک سلوشن پر بھی توجہ دینی چاہیے۔پرائمر بینڈز ہونے چاہئیں، اور دونوں پرائمر بینڈز کی چمک تقریباً ایک جیسی ہونی چاہیے۔مثال کے طور پر، ایک پرائمر میں بینڈ ہے اور دوسرے پرائمر میں کوئی بینڈ نہیں ہے۔سٹرپس کے لیے، PCR اس وقت ناکام ہو سکتا ہے اور اسے پرائمر سنتھیسس یونٹ کے ساتھ گفت و شنید کے ذریعے حل کیا جانا چاہیے۔اگر ایک پرائمر کی چمک زیادہ ہے اور دوسرے کی چمک کم ہے، تو پرائمر کو کم کرتے وقت ارتکاز کو متوازن رکھیں۔

③ پرائمر کو زیادہ ارتکاز اور کم مقدار میں ذخیرہ کیا جانا چاہیے تاکہ بار بار جمنے اور پگھلنے یا فریج میں طویل مدتی ذخیرہ کرنے سے بچایا جا سکے، جو پرائمر کے بگاڑ اور انحطاط کا باعث بن سکتا ہے۔

④پرائمر کا ڈیزائن غیر معقول ہے، جیسے پرائمر کی لمبائی کافی نہیں ہے، پرائمر وغیرہ کے درمیان ڈائمرز بنتے ہیں۔اگر ارتکاز بہت زیادہ ہے تو یہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی خصوصیت کو کم کر سکتا ہے۔اگر ارتکاز بہت کم ہے، تو یہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی پیداوار کو متاثر کرے گا اور یہاں تک کہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کو بینڈوں کو بڑھانے کے بغیر ناکام ہونے کا سبب بنے گا۔رد عمل کے حجم میں تبدیلیاں: عام طور پر پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے استعمال ہونے والے حجم 20ul، 30ul، اور 50ul ہوتے ہیں۔یا 100ul، پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے کون سا حجم استعمال کیا جانا چاہیے سائنسی تحقیق اور کلینیکل ٹیسٹنگ کے مختلف مقاصد کے مطابق سیٹ کیا گیا ہے۔چھوٹا حجم بنانے کے بعد، جیسا کہ 20ul، اور پھر بڑا حجم بنانے کے بعد، آپ کو شرطوں پر عمل کرنا چاہیے، ورنہ یہ آسانی سے ناکام ہو جائے گا۔جسمانی وجوہات: پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے ڈینیچریشن بہت اہم ہے۔اگر ڈینیچریشن کا درجہ حرارت کم ہے اور ڈینیچریشن کا وقت کم ہے، تو غلط منفی ہونے کا بہت امکان ہے۔اینیلنگ کا درجہ حرارت بہت کم ہے، جو غیر مخصوص پروردن کا سبب بن سکتا ہے اور مخصوص پروردن کی کارکردگی کو کم کر سکتا ہے۔اینیلنگ کا درجہ حرارت بہت زیادہ ہے۔پرائمر کے ٹیمپلیٹس کے پابند ہونے کو بہت زیادہ متاثر کرتا ہے اور پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو کم کرتا ہے۔کبھی کبھی ایمپلیفائر یا پانی میں گھلنشیل برتن میں ڈینیچریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن درجہ حرارت کو چیک کرنے کے لیے معیاری تھرمامیٹر استعمال کرنا ضروری ہوتا ہے۔پی سی آر کی ناکامی کی ایک وجہ یہ بھی ہے۔ہدف کی ترتیب میں تغیر: اگر ہدف کی ترتیب کو تبدیل یا حذف کر دیا جاتا ہے، جس سے پرائمر کی ٹیمپلیٹ سے مخصوص پابندی متاثر ہوتی ہے، یا پرائمر اور ٹیمپلیٹ ہدف کی ترتیب کے ایک مخصوص حصے کے حذف ہونے کی وجہ سے تکمیلی ترتیب سے محروم ہو جاتے ہیں، PCR پروردن کامیاب نہیں ہو گا.

2. غلط مثبت PCR ایمپلیفیکیشن بینڈ جو ظاہر ہوتا ہے وہ ٹارگٹ سیکوینس بینڈ کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، اور بعض اوقات بینڈ زیادہ منظم اور روشن ہوتا ہے۔نامناسب پرائمر ڈیزائن: منتخب ایمپلیفیکیشن ترتیب میں غیر ٹارگٹ ایمپلیفیکیشن ترتیب کے ساتھ ہم آہنگی ہوتی ہے، لہذا جب PCR ایمپلیفیکیشن کو انجام دیتے ہیں، تو ایمپلیفائیڈ PCR پروڈکٹ ایک غیر ہدفی ترتیب ہے۔اگر ہدف کی ترتیب بہت مختصر ہے یا پرائمر بہت چھوٹا ہے، تو غلط مثبت آسانی سے ہو سکتا ہے۔پرائمر کو دوبارہ ڈیزائن کرنے کی ضرورت ہے۔ہدف کی ترتیب یا امپلیفیکیشن مصنوعات کی کراس آلودگی: اس آلودگی کی دو وجوہات ہیں: پہلی، پورے جینوم یا بڑے ٹکڑوں کی کراس آلودگی، جو غلط مثبتات کا باعث بنتی ہے۔اس جھوٹے مثبت کو درج ذیل طریقوں سے حل کیا جا سکتا ہے: ٹارگٹ سیکوئنس کو نمونے کی بندوق میں چوسنے یا سینٹری فیوج ٹیوب سے باہر چھڑکنے سے روکنے کے لیے کام کرتے وقت محتاط اور نرمی برتیں۔انزائمز اور مادوں کے علاوہ جو زیادہ درجہ حرارت کو برداشت نہیں کر سکتے، تمام ری ایجنٹس یا آلات کو ہائی پریشر سے جراثیم سے پاک کیا جانا چاہیے۔تمام سینٹری فیوج ٹیوبیں اور نمونے کے انجیکشن پائپیٹ ٹپس کو ایک بار استعمال کرنا چاہیے۔اگر ضروری ہو تو، موجود نیوکلک ایسڈ کو تباہ کرنے کے لیے نمونہ شامل کرنے سے پہلے ری ایکشن ٹیوبوں اور ری ایجنٹس کو الٹرا وایلیٹ روشنی سے شعاع کیا جاتا ہے۔دوسرا ہوا میں نیوکلک ایسڈ کے چھوٹے ٹکڑوں کی آلودگی ہے۔یہ چھوٹے ٹکڑے ہدف کی ترتیب سے چھوٹے ہیں، لیکن ان میں کچھ مخصوص ہم آہنگی ہے۔ان کو ایک دوسرے کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے، اور پرائمر کے تکمیلی ہونے کے بعد، PCR مصنوعات کو بڑھایا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں جھوٹے مثبت نتائج نکلتے ہیں، جنہیں نیسٹڈ PCR طریقوں سے کم یا ختم کیا جا سکتا ہے۔

 

3. غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن بینڈ ظاہر ہوتے ہیں PCR ایمپلیفیکیشن کے بعد ظاہر ہونے والے بینڈ متوقع سائز سے مطابقت نہیں رکھتے، یا تو بڑے یا چھوٹے، یا دونوں مخصوص ایمپلیفیکیشن بینڈ اور غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن بینڈ ایک ہی وقت میں ظاہر ہوتے ہیں۔غیر مخصوص بینڈ کے ظاہر ہونے کی وجوہات یہ ہیں: سب سے پہلے، پرائمر ہدف کی ترتیب کے مکمل طور پر تکمیلی نہیں ہوتے ہیں، یا پرائمر ڈائمر بنانے کے لیے جمع ہوتے ہیں۔دوسری وجہ یہ ہے کہ Mg2+ آئن کا ارتکاز بہت زیادہ ہے، اینیلنگ کا درجہ حرارت بہت کم ہے، اور PCR سائیکلوں کی تعداد بہت زیادہ ہے۔دوسرا عنصر انزائم کا معیار اور مقدار ہے۔بعض ذرائع سے آنے والے انزائمز اکثر غیر مخصوص بینڈز کا شکار ہوتے ہیں لیکن دوسرے ذرائع سے انزائمز نہیں ہوتے۔خامروں کی ضرورت سے زیادہ مقدار بعض اوقات غیر مخصوص وسعت کا باعث بن سکتی ہے۔جوابی اقدامات میں شامل ہیں: اگر ضروری ہو تو پرائمر کو دوبارہ ڈیزائن کریں۔انزائم کی مقدار کو کم کریں یا اسے کسی اور ذریعہ سے تبدیل کریں۔پرائمر کی مقدار کو کم کریں، ٹیمپلیٹ کی مقدار کو مناسب طریقے سے بڑھائیں، اور سائیکلوں کی تعداد کو کم کریں۔اینیلنگ کے درجہ حرارت کو مناسب طریقے سے بڑھائیں یا ٹو ٹمپریچر پوائنٹ کا طریقہ استعمال کریں (93 ° C پر ڈینیچریشن، اینیلنگ اور 65 ° C کے ارد گرد توسیع)۔

 

4. فلکی ڈریگ یا سمیئرز ظاہر ہوتے ہیں PCR ایمپلیفیکیشن بعض اوقات سمیرڈ بینڈ، شیٹ نما بینڈ یا قالین نما بینڈ کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں۔وجوہات اکثر بہت زیادہ انزائم یا انزائم کے خراب معیار، بہت زیادہ dNTP ارتکاز، بہت زیادہ Mg2+ ارتکاز، بہت کم اینیلنگ درجہ حرارت، اور بہت زیادہ چکروں کی وجہ سے ہوتی ہیں۔انسدادی اقدامات میں شامل ہیں: ① انزائم کی مقدار کو کم کریں، یا انزائم کو کسی اور ذریعہ سے تبدیل کریں۔②dNTP کے ارتکاز کو کم کریں۔مناسب طریقے سے Mg2+ ارتکاز کو کم کریں۔ٹیمپلیٹس کی مقدار میں اضافہ کریں اور سائیکلوں کی تعداد کو کم کریں۔