PCR FAQ 1. פאַלש נעגאַטיוו, קיין אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנד איז ארויס
1 פאַלש נעגאַטיוו, קיין אַמפּלאַפייד באַנד אויס די שליסל אַספּעקץ פון די פּקר אָפּרוף זענען
① צוגרייטונג פון מוסטער נוקלעיק זויער
② אָנפאַנגער קוואַליטעט און ספּעסיפיקאַטי
③ ענזיים קוואַליטעט און
④ פּקר ציקל טנאָים.צו געפֿינען די סיבות, אַנאַליסיס און פאָרשונג זאָל אויך זיין געפירט אויף די אויבן לינקס.
מוסטער:
① דער מוסטער כּולל טומע פּראָטעינס
② דער מוסטער כּולל טאַק ענזיים ינכיבאַטערז
③ די פּראָטעינס אין די מוסטער זענען נישט דיידזשעסטיד און אַוועקגענומען, ספּעציעל די היסטאָנעס אין טשראָמאָסאָומז
④ צו פיל איז פאַרפאַלן בעשאַס די יקסטראַקשאַן און צוגרייטונג פון די טעמפּלאַטע, אָדער פענאָל איז ינכיילד
⑤ די מוסטער נוקלעיק זויער איז נישט גאָר דענאַטורעד.ווען די קוואַליטעט פון ענזימעס און אָנפאַנגערס איז גוט, אויב אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנדס טאָן ניט דערשייַנען, עס איז רובֿ מסתּמא אַז עס איז עפּעס פאַלש מיט די דיידזשעסטשאַן פּראָצעס פון די ספּעסאַמאַן אָדער די מוסטער נוקלעיק זויער יקסטראַקשאַן פּראָצעס.דעריבער, אַ עפעקטיוו און סטאַביל דיידזשעסטשאַן לייזונג מוזן זיין צוגעגרייט, און די פּראָצעדור זאָל זיין פאַרפעסטיקט און זאָל נישט זיין טשיינדזשד אין וועט..ענזיים ינאַקטיוויישאַן: עס איז נייטיק צו פאַרבייַטן די נייַ ענזיים, אָדער נוצן ביידע אַלט און נייַ ענזימעס אין דער זעלביקער צייט צו פונאַנדערקלייַבן צי פאַלש נעגאַטיווע זענען געפֿירט דורך אָנווער אָדער ניט גענוגיק ענזיים טעטיקייט.עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז מאל די טאַק ענזיים איז פארגעסן. פּרימערז: אָנפאַנגער קוואַליטעט, אָנפאַנגער קאַנסאַנטריישאַן, און צי די קאַנסאַנטריישאַנז פון די צוויי אָנפאַנגער זענען סאַמעטריקאַל זענען פּראָסט סיבות פֿאַר פּקר דורכפאַל אָדער אַנסאַטיספאַקטערי אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנדס און גרינג דיפיוזשאַן.עס זענען פּראָבלעמס מיט די קוואַליטעט פון אָנפאַנגער סינטעז אין עטלעכע באַטשאַז.איינער פון די צוויי פּרימערז האט אַ הויך קאַנסאַנטריישאַן און די אנדערע האט אַ נידעריק קאַנסאַנטריישאַן, ריזאַלטינג אין נידעריק-עפעקטיווקייַט אַסיממעטריק אַמפּלאַפאַקיישאַן.
די קאַונטערמעזשערז זענען:
① אויסקלייַבן אַ גוט אָנפאַנגער סינטעז אַפּאַראַט.
② די קאַנסאַנטריישאַן פון אָנפאַנגער זאָל ניט בלויז קוקן אין די אָד ווערט, אָבער אויך צוקוקנ זיך צו די אָנפאַנגער לאַגער לייזונג פֿאַר אַגאַראָסע געל עלעקטראָפאָרעסיס.עס מוזן זיין אָנפאַנגער באַנדס, און די ברייטנאַס פון די צוויי אָנפאַנגער באַנדס זאָל זיין בעערעך דער זעלביקער.פֿאַר בייַשפּיל, איין אָנפאַנגער האט אַ באַנד און די אנדערע אָנפאַנגער האט קיין באַנד.פֿאַר סטריפּס, PCR קען דורכפאַל אין דעם צייט און זאָל זיין ריזאַלווד דורך פאַרהאַנדלונג מיט די אָנפאַנגער סינטעז אַפּאַראַט.אויב איין אָנפאַנגער האט הויך ברייטנאַס און די אנדערע האט נידעריק ברייטנאַס, וואָג די קאַנסאַנטריישאַנז ווען דילוטינג די אָנפאַנגער.
③ פּרימערז זאָל זיין סטאָרד אין הויך קאַנסאַנטריישאַן און קליין קוואַנטאַטיז צו פאַרמייַדן ריפּיטיד ייַז קאַלט און טאָינג אָדער לאַנג-טערמין סטאָרידזש אין די פרידזשידער, וואָס קען פירן צו דיטיריעריישאַן און דערנידעריקונג פון די פּרימערז.
④ די אָנפאַנגער פּלאַן איז קרום, אַזאַ ווי די אָנפאַנגער לענג איז נישט גענוג, דימערז זענען געשאפן צווישן אָנפאַנגער, אאז"ו ו. מג2+ קאַנסאַנטריישאַן: מג2+ יאָן קאַנסאַנטריישאַן האט אַ גרויס השפּעה אויף פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו הויך, דאָס קען רעדוצירן די ספּעסיפיסיטי פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן.אויב די קאַנסאַנטריישאַן איז צו נידעריק, דאָס וועט ווירקן די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן טראָגן און אפילו פאַרשאַפן די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן צו פאַרלאָזן אָן אַמפּלאַפייינג באַנדס.ענדערונגען אין אָפּרוף באַנד: יוזשאַוואַלי די וואַליומז געניצט פֿאַר פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן זענען 20ul, 30ul, און 50ul.אָדער 100ul, וואָס באַנד זאָל זיין געוויינט פֿאַר פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן איז באַשטימט לויט פאַרשידענע צוועקן פון וויסנשאפטלעכע פאָרשונג און קליניש טעסטינג.נאָך מאכן אַ קליין באַנד, אַזאַ ווי 20ול, און דעמאָלט מאַכן אַ גרעסערע באַנד, איר מוזן נאָכגיין די באדינגונגען, אַנדערש עס וועט לייכט פאַרלאָזן.גשמיות סיבות: דינאַטוראַטיאָן איז זייער וויכטיק פֿאַר פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן.אויב די דענאַטוראַטיאָן טעמפּעראַטור איז נידעריק און די דענאַטוראַטיאָן צייט איז קורץ, פאַלש נעגאַטיוועס זענען זייער מסתּמא צו פאַלן;די אַנילינג טעמפּעראַטור איז אויך נידעריק, וואָס קענען אָנמאַכן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן און רעדוצירן די ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן עפעקטיווקייַט.די אַנילינג טעמפּעראַטור איז צו הויך.העכסט אַפעקץ די ביינדינג פון אָנפאַנגער צו טעמפּלאַטעס און ראַדוסאַז די עפעקטיווקייַט פון PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן.מאל עס איז נייטיק צו נוצן אַ נאָרמאַל טערמאָמעטער צו קאָנטראָלירן די דינאַטוראַטיאָן, אַנילינג און פאַרלענגערונג טעמפּעראַטורעס אין די אַמפּלאַפייער אָדער וואַסער-סאַליאַבאַל טאָפּ.דאָס איז אויך איינער פון די סיבות פֿאַר פּקר דורכפאַל.ציל סיקוואַנס ווערייישאַן: אויב די ציל סיקוואַנס איז מיוטייטיד אָדער אויסגעמעקט, וואָס אַפעקץ די ספּעציפיש ביינדינג פון די אָנפאַנגער צו די מוסטער, אָדער די אָנפאַנגער און מוסטער פאַרלירן די קאַמפּלאַמענטשי סיקוואַנס רעכט צו די דילישאַן פון אַ זיכער אָפּשניט פון די ציל סיקוואַנס, די PCR אַמפּלאַפאַקיישאַן וועט ניט זיין געראָטן.
2.פאַלש positive די פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנד וואָס איז קאָנסיסטענט מיט די ציל סיקוואַנס באַנד, און מאל די באַנד איז מער אָרדערלי און ברייטער.ינאַפּראָופּרייט אָנפאַנגער פּלאַן: די אויסגעקליבן אַמפּלאַפאַקיישאַן סיקוואַנס האט כאָומאַלאַדזשי מיט די ניט-ציל אַמפּלאַפאַקיישאַן סיקוואַנס, אַזוי ווען פּערפאָרמינג פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, די אַמפּלאַפייד פּקר פּראָדוקט איז אַ ניט-ציל סיקוואַנס.אויב די ציל סיקוואַנס איז צו קורץ אָדער די אָנפאַנגער איז צו קורץ, פאַלש פּאַזאַטיווז קען לייכט פּאַסירן.פּרימערז דאַרפֿן צו זיין רידיזיינד.קרייַז-קאַנטאַמאַניישאַן פון ציל סיקוואַנסיז אָדער אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקטן: עס זענען צוויי סיבות פֿאַר דעם קאַנטאַמאַניישאַן: ערשטער, קרייַז-קאַנטאַמאַניישאַן פון די גאנצע גענאָמע אָדער גרויס פראַגמאַנץ, וואָס פירן צו פאַלש פּאַזאַטיווז.דעם פאַלש positive קענען זיין סאַלווד דורך די פאלגענדע מעטהאָדס: זיין אָפּגעהיט און מילד ווען אַפּערייטינג צו פאַרמייַדן די ציל סיקוואַנס פון סאַקט אין די מוסטער ביקס אָדער ספּלאַשט אויס פון די סענטריפודזש רער.אַחוץ פֿאַר ענזימעס און סאַבסטאַנסיז וואָס קענען נישט וויטסטאַנד הויך טעמפּעראַטורעס, אַלע רייידזשאַנץ אָדער ויסריכט זאָל זיין סטעראַלייזד דורך הויך דרוק.כל סענטריפודזש טובז און מוסטער ינדזשעקשאַן פּייפּעט עצות זאָל זיין געוויינט אַמאָל.אויב נייטיק, די אָפּרוף טובז און רייידזשאַנץ זענען יריידיייטיד מיט אַלטראַווייאַליט ליכט איידער אַדינג די ספּעסאַמאַן צו צעשטערן די פאָרשטעלן נוקלעיק אַסאַדז.די רגע איז די קאַנטאַמאַניישאַן פון קליין פראַגמאַנץ פון נוקלעיק אַסאַדז אין די לופט.די קליין פראַגמאַנץ זענען קירצער ווי די ציל סיקוואַנס, אָבער האָבן זיכער האָמאָלאָגי.זיי קענען זיין ספּלייסט צו יעדער אנדערער, און נאָך קאַמפּלאַמענטשי צו די פּרימערז, די פּקר פּראָדוקטן קענען זיין אַמפּלאַפייד, ריזאַלטינג אין פאַלש פּאַזאַטיווז, וואָס קענען זיין רידוסט אָדער ילימאַנייטאַד דורך נעסטעד פּקר מעטהאָדס.
3. נאָן-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנדס דערשייַנען די באַנדס וואָס דערשייַנען נאָך פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן זענען סתירה מיט די דערוואַרט גרייס, אָדער גרעסערע אָדער קלענערער, אָדער ביידע ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנדס און ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן באַנדס דערשייַנען אין דער זעלביקער צייט.די סיבות פֿאַר די אויסזען פון ניט-ספּעציפיש באַנדס זענען: ערשטער, די פּרימערז זענען נישט גאָר קאַמפּלאַמענטשי צו די ציל סיקוואַנס, אָדער די פּרימערז זענען געמיינזאַם צו פאָרעם דימערס.די רגע סיבה איז אַז די Mg2+ יאָן קאַנסאַנטריישאַן איז צו הויך, די אַנילינג טעמפּעראַטור איז צו נידעריק און די נומער פון פּקר סייקאַלז איז צו הויך.די רגע פאַקטאָר איז די קוואַליטעט און קוואַנטיטי פון די ענזיים.ענזימעס פון עטלעכע קוואלן זענען אָפט פּראָנע צו ניט-ספּעציפיש באַנדס אָבער ענזימעס פון אנדערע קוואלן טאָן ניט.יבעריק אַמאַונץ פון ענזימעס קענען מאל פירן צו ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן.די קאַונטערמעזשערז אַרייַננעמען: רידיזיין פּרימערז אויב נייטיק.רעדוצירן די סומע פון ענזיים אָדער פאַרבייַטן עס מיט אן אנדער מקור.רעדוצירן די סומע פון פּרימערז, פאַרגרעסערן די סומע פון מוסטער אַפּראָופּרייטלי און רעדוצירן די נומער פון סייקאַלז.פאַרגרעסערן די אַנילינג טעמפּעראַטור אַפּראָופּרייטלי אָדער נוצן די צוויי-טעמפּעראַטור פונט אופֿן (דענאַטוראַטיאָן ביי 93 ° C, אַנילינג און פאַרלענגערונג אַרום 65 ° C).
4.פלאַקי שלעפּן אָדער סמירז דערשייַנען פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן מאל אויס ווי סמירד באַנדס, בויגן-ווי באַנדס אָדער טעפּעך-ווי באַנדס.די סיבות זענען אָפט געפֿירט דורך צו פיל ענזיים אָדער נעבעך קוואַליטעט פון ענזיים, צו הויך דנטפּ קאַנסאַנטריישאַן, צו הויך Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן, צו נידעריק אַנילינג טעמפּעראַטור און צו פילע סייקאַלז.די קאַונטערמעזשערז אַרייַננעמען: ① רעדוצירן די סומע פון ענזיים, אָדער פאַרבייַטן די ענזיים מיט אן אנדער מקור.② רעדוצירן די קאַנסאַנטריישאַן פון דנטפּ.רידוסינג די Mg2+ קאַנסאַנטריישאַן אַפּראָופּרייטלי.פאַרגרעסערן די נומער פון טעמפּלאַטעס און רעדוצירן די נומער פון סייקאַלז