Olbaltumvielu atdalīšana un attīrīšana tiek plaši izmantota bioķīmijas pētījumos un lietošanā, un tā ir svarīga darbības prasme.Tipiskā eikariotu šūna var saturēt tūkstošiem dažādu proteīnu, daži ir ļoti bagāti un daži satur tikai dažas kopijas.Lai izpētītu noteiktuolbaltumvielas, vispirms ir nepieciešams attīrīt proteīnu no citiem proteīniem un neolbaltumvielu molekulām.

1. Izsālīšanas metodeolbaltumvielas:

Neitrālais sāls būtiski ietekmē olbaltumvielu šķīdību.Parasti, palielinoties sāls koncentrācijai zemā sāls koncentrācijā, proteīna šķīdība palielinās.To sauc par sālīšanu;turpinot palielināties sāls koncentrācijai, Olbaltumvielu šķīdība dažādās pakāpēs samazinās un izdalās viena pēc otras.Šo parādību sauc par izsālīšanu.

2. Izoelektriskā punkta sakraušanas metode:

Elektrostatiskā atgrūšanās starp daļiņām ir vismazākā, ja proteīns ir statisks, tāpēc arī šķīdība ir vismazākā.Dažādu olbaltumvielu izoelektriskie punkti ir atšķirīgi.Kondicionēšanas šķīduma pH var izmantot, lai sasniegtu proteīna izoelektrisko punktu. Padariet to uzkrāšanos, taču šo metodi reti izmanto vienu pašu, un to var apvienot ar izsālīšanas metodi.

3. Dialīze un ultrafiltrācija:

Dialīzē tiek izmantota daļēji caurlaidīga membrāna, lai atdalītu dažādu molekulu izmēru proteīnus.Ultrafiltrācijas metode izmanto augstu spiedienu vai centrbēdzes spēku, lai ūdens un citas mazas izšķīdušās vielas molekulas izietu cauri puscaurlaidīgai membrānai, savukārtolbaltumvielaspaliek uz membrānas.Jūs varat izvēlēties dažādus poru izmērus, lai pārtvertu dažādu molekulmasu proteīnus.

4. Gēla filtrēšanas metode:

To sauc arī par izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju vai molekulāro sietu hromatogrāfiju, šī ir viena no visnoderīgākajām metodēm olbaltumvielu maisījumu atdalīšanai pēc molekulārā izmēra.Kolonnā biežāk izmantotie iepakojuma materiāli ir glikozes želeja (Sephadex ged) un agarozes želeja (agarozes želeja).

5. Elektroforēze:

Vienādos pH apstākļos dažādas olbaltumvielas var atdalīt, ņemot vērā to atšķirīgo molekulmasu un dažādus lādiņus elektriskajā laukā.Ir vērts pievērst uzmanību izoelektriskajai komplekta elektroforēzei, kurā kā nesējs tiek izmantots amfolits.Elektroforēzes laikā amfolits veido pH gradientu, kas pakāpeniski tiek pievienots no pozitīvā elektroda negatīvajam elektrodam.Kad proteīns ar noteiktu lādiņu tajā peldēs, tas sasniegs viens otru.Elektriskā punkta pH pozīcija ir pārtraukta, un šo metodi var izmantot dažādu proteīnu analīzei un sagatavošanai.

6.Jonu sakaru hromatogrāfija:

jonu sakaru aģenti ir katjonu saziņas līdzekļi (piemēram, karboksimetilceluloze; CM-celuloze) un anjonu sakaru aģenti (dietilaminoetilceluloze).Izejot cauri jonu komunikācijas hromatogrāfijas kolonnai, proteīns ar pretēju lādiņu jonu sakaru aģentam tiek adsorbēts uz jonu sakaru aģenta un pēc tam adsorbēts.olbaltumvielastiek eluēts, mainot pH vai jonu stiprumu.

7. Afinitātes hromatogrāfija:

Afinitātes hromatogrāfija ir ārkārtīgi noderīga proteīnu atdalīšanas metode.Bieži vien ir nepieciešams tikai viens solis, lai atdalītu noteiktu proteīnu no netīra olbaltumvielu maisījuma ar augstu tīrības pakāpi.

Šī metode ir balstīta uz noteiktu proteīnu specifisku, nevis kovalentu saistīšanos ar citu molekulu, ko sauc par ligandu (ligandu).

Pamatprincips:

olbaltumvielas pastāv netīrā maisījumā audos vai šūnās, un katrs šūnu veids satur tūkstošiem dažādu proteīnu.Tāpēc atšķirība starp olbaltumvielām ir svarīga bioķīmijas sastāvdaļa, un tā nav bijusi viena.Vai arī gatavu metožu komplekts var noņemt jebkāda veida olbaltumvielas no nekārtīga jaukta proteīna, tāpēc vairākas metodes bieži tiek izmantotas kombinācijā.