Ločevanje in čiščenje beljakovin se pogosto uporablja v biokemijskih raziskavah in uporabi ter je pomembna operativna veščina.Tipična evkariontska celica lahko vsebuje na tisoče različnih proteinov, nekateri so zelo bogati, nekateri pa vsebujejo le nekaj kopij.Da bi preučili določenobeljakovine, je potrebno najprej očistiti beljakovine od drugih beljakovin in neproteinskih molekul.

1. Metoda soljenjabeljakovine:

Nevtralna sol pomembno vpliva na topnost beljakovin.Na splošno se s povečanjem koncentracije soli pri nizki koncentraciji soli poveča topnost beljakovin.To se imenuje soljenje;ko koncentracija soli še naprej narašča, se topnost beljakovin v različnih stopnjah zmanjša in se ena za drugo ločuje.Ta pojav imenujemo izsoljenje.

2. Metoda zlaganja izoelektričnih točk:

Elektrostatični odboj med delci je najmanjši, ko je protein statičen, zato je tudi topnost najmanjša.Izoelektrične točke različnih proteinov so različne.pH kondicionirne raztopine se lahko uporabi za doseganje izoelektrične točke proteina, da se kopiči, vendar se ta metoda redko uporablja sama in jo je mogoče kombinirati z metodo izsoljevanja.

3. Dializa in ultrafiltracija:

Dializa uporablja polprepustno membrano za ločevanje beljakovin različnih velikosti molekul.Metoda ultrafiltracije uporablja visok tlak ali centrifugalno silo, da voda in druge majhne molekule topljenca preidejo skozi polprepustno membrano, medtem kobeljakovineostane na membrani.Izberete lahko različne velikosti por, da prestrežete beljakovine različnih molekulskih mas.

4. Metoda gelske filtracije:

Imenuje se tudi kromatografija z izključitvijo velikosti ali kromatografija z molekularnim sitom in je ena najbolj uporabnih metod za ločevanje beljakovinskih mešanic glede na velikost molekul.Pogosteje uporabljena pakirna materiala v koloni sta glukozni gel (Sephadex ged) in agarozni gel (agarozni gel).

5.Elektroforeza:

Pri enakih pH pogojih je mogoče ločiti različne proteine ​​zaradi različnih molekulskih mas in različnih nabojev v električnem polju.Vredno je biti pozoren na izoelektrično nastavljeno elektroforezo, ki kot nosilec uporablja amfolit.Med elektroforezo amfolit tvori gradient pH, ki se postopoma dodaja od pozitivne elektrode k negativni elektrodi.Ko beljakovina z določenim nabojem plava v njem, se bosta dosegla drug drugega.Položaj pH električne točke je diskontinuiran in to metodo je mogoče uporabiti za analizo in pripravo različnih beljakovin.

6. Ionska komunikacijska kromatografija:

ionska komunikacijska sredstva vključujejo kationska komunikacijska sredstva (kot je karboksimetil celuloza; CM-celuloza) in anionska komunikacijska sredstva (dietilaminoetil celuloza).Pri prehodu skozi kolono za ionsko komunikacijsko kromatografijo se protein z nasprotnim nabojem kot sredstvo za ionsko komunikacijo adsorbira na sredstvu za ionsko komunikacijo, nato pa se adsorbirabeljakovinese eluira s spremembo pH ali ionske jakosti.

7. Afinitetna kromatografija:

Afinitetna kromatografija je izjemno uporabna metoda za ločevanje beljakovin.Pogosto je potreben samo en korak za ločevanje določenega proteina, ki ga je treba očistiti, iz neurejene beljakovinske mešanice z visoko čistostjo.

Ta metoda temelji na specifični in ne kovalentni vezavi določenih proteinov na drugo molekulo, imenovano ligand (Ligand).

Osnovno načelo:

beljakovine obstajajo v neurejeni mešanici v tkivih ali celicah in vsaka vrsta celice vsebuje na tisoče različnih beljakovin.Zato je razlikovanje med beljakovinami pomemben del biokemije in ni bilo samo.Ali pa nabor že pripravljenih metod lahko odstrani katero koli vrsto beljakovin iz neurejenih mešanih beljakovin, zato se pogosto uporablja več metod v kombinaciji.