Розділення та очищення білків широко використовується в біохімічних дослідженнях і застосуванні та є важливою операційною навичкою.Типова еукаріотична клітина може містити тисячі різних білків, деякі з них дуже багаті, а деякі містять лише кілька копій.З метою вивчення певногобілок, необхідно спочатку очистити білок від інших білків і небілкових молекул.

1. Спосіб висолюваннябілок:

Нейтральна сіль істотно впливає на розчинність білка.Як правило, зі збільшенням концентрації солі при низькій концентрації солі розчинність білка зростає.Це називається солінням;коли концентрація солі продовжує збільшуватися, розчинність білка різним ступенем зменшується і виділяється один за одним.Це явище називається висолюванням.

2. Метод накладання ізоелектричної точки:

Електростатичне відштовхування між частинками є найменшим, коли білок статичний, тому розчинність також найменша.Ізоелектричні точки різних білків різні.РН кондиціонуючого розчину можна використовувати для досягнення ізоелектричної точки білка, щоб він накопичувався, але цей метод рідко використовується окремо, і його можна поєднувати з методом висолювання.

3.Діаліз і ультрафільтрація:

Діаліз використовує напівпроникну мембрану для розділення білків різного молекулярного розміру.Метод ультрафільтрації використовує високий тиск або відцентрову силу, щоб вода та інші невеликі молекули розчиненої речовини проходили через напівпроникну мембрану, тоді якбілокзалишається на мембрані.Ви можете вибрати різні розміри пор для перехоплення білків різної молекулярної маси.

4. Метод гель-фільтрації:

Також званий ексклюзійною хроматографією або молекулярно-ситовою хроматографією, це один із найкорисніших методів розділення білкових сумішей за молекулярним розміром.Пакувальні матеріали, які частіше використовуються в колонці, - це гель глюкози (Sephadex ged) і агарозний гель (agarose gel).

5.Електрофорез:

За однакових умов pH різні білки можуть бути розділені через їхню різну молекулярну масу та різний заряд в електричному полі.Варто звернути увагу на ізоелектричний сет-електрофорез, при якому в якості носія використовується амфоліт.Під час електрофорезу амфоліт утворює градієнт pH, який поступово додається від позитивного електрода до негативного.Коли білок з певним зарядом плаває в ньому, вони досягнуть один одного.Положення pH електричної точки є переривчастим, і цей метод можна використовувати для аналізу та приготування різних білків.

6.Іонна комунікаційна хроматографія:

іонні зв'язувальні агенти включають катіонні зв'язувальні агенти (такі як карбоксиметилцелюлоза; CM-целюлоза) та аніонні зв'язувальні агенти (діетиламіноетилцелюлоза).При проходженні через колонку іонно-зв’язувальної хроматографії білок із зарядом, протилежним заряду іонно-зв’язуючого агента, адсорбується на іонно-зв’язувальному агенті, а потім адсорбуєтьсябілокелююється шляхом зміни рН або іонної сили.

7. Афінна хроматографія:

Афінна хроматографія є надзвичайно корисним методом для розділення білків.Часто потрібен лише один крок, щоб відокремити певний білок, який потрібно очистити, від безладної білкової суміші високої чистоти.

Цей метод заснований на специфічному, а не ковалентному зв'язуванні певних білків з іншою молекулою, яка називається лігандом (Ligand).

Основний принцип:

білки існують у безладній суміші в тканинах або клітинах, і кожен тип клітини містить тисячі різних білків.Таким чином, відмінність між білками є важливою частиною біохімії, і вона була не єдиною.Або набір готових методів може видалити будь-який вид протеїну з безладної змішаної протеїну, тому кілька методів часто використовуються в комбінації.