Preguntes freqüents sobre PCR 1. Fals negatiu, no apareix cap banda d'amplificació 2. Fals positiu 3. Apareixen bandes d'amplificació no específiques 4. Apareixen tires d'arrossegament escamoses o bandes de frotis:
1 Fals negatiu, no apareix cap banda amplificada Els aspectes clau de la reacció de PCR són
① preparació d'àcid nucleic plantilla
② qualitat i especificitat de la imprimació
③ qualitat de l'enzim i
④ Condicions del cicle de PCR.Per trobar els motius, també s'han de fer anàlisis i investigacions als enllaços anteriors.
Plantilla:
① La plantilla conté proteïnes d'impureses
② La plantilla conté inhibidors de l'enzim Taq
③ Les proteïnes de la plantilla no es digereixen i s'eliminen, especialment les histones dels cromosomes
④ Es va perdre massa durant l'extracció i preparació de la plantilla, o es va inhalar fenol
⑤L'àcid nucleic de plantilla no està completament desnaturalitzat.Quan la qualitat dels enzims i els primers és bona, si no apareixen bandes d'amplificació, el més probable és que hi hagi alguna cosa malament amb el procés de digestió de l'espècimen o el procés d'extracció d'àcid nucleic de plantilla.Per tant, s'ha de preparar una solució de digestió eficaç i estable, i el procediment s'ha de fixar i no s'ha de canviar a voluntat..Inactivació enzimàtica: és necessari substituir l'enzim nou, o utilitzar alhora enzims antics i nous per analitzar si els falsos negatius són causats per la pèrdua o una activitat enzimàtica insuficient.Cal tenir en compte que de vegades s'oblida l'enzim Taq. Cebadors: la qualitat del cebador, la concentració del cebador i si les concentracions dels dos cebadors són simètriques són motius habituals de fracàs de la PCR o bandes d'amplificació insatisfactòries i fàcil difusió.Hi ha problemes amb la qualitat de la síntesi d'imprimació en alguns lots.Un dels dos primers té una concentració elevada i l'altre una concentració baixa, donant lloc a una amplificació asimètrica de baixa eficiència.
Les contramesures són:
① Seleccioneu una bona unitat de síntesi d'imprimació.
② La concentració d'imprimadors no només ha de mirar el valor OD, sinó que també ha de prestar atenció a la solució d'imprimació per a l'electroforesi en gel d'agarosa.Hi ha d'haver bandes d'imprimació i la brillantor de les dues bandes d'imprimació hauria de ser aproximadament la mateixa.Per exemple, un cebador té una banda i l'altre cebador no té banda.Per a les tires, la PCR pot fallar en aquest moment i s'ha de resoldre mitjançant la negociació amb la unitat de síntesi d'imprimació.Si una imprimació té una brillantor alta i l'altra una brillantor baixa, equilibreu les concentracions en diluir les imprimacions.
③ Els imprimadors s'han d'emmagatzemar en alta concentració i petites quantitats per evitar la congelació i descongelació repetida o l'emmagatzematge a llarg termini a la nevera, que pot provocar el deteriorament i la degradació de les imprimacions.
④El disseny de l'imprimació no és raonable, com ara que la longitud de l'imprimació no és suficient, es formen dímers entre els primers, etc. Concentració de Mg2+: la concentració d'ions Mg2+ té una gran influència en l'eficiència de l'amplificació de PCR.Si la concentració és massa alta, pot reduir l'especificitat de l'amplificació per PCR.Si la concentració és massa baixa, afectarà el rendiment de l'amplificació de la PCR i fins i tot farà que l'amplificació de la PCR falli sense amplificar les bandes.Canvis en el volum de reacció: normalment els volums utilitzats per a l'amplificació per PCR són 20ul, 30ul i 50ul.O 100ul, quin volum s'ha d'utilitzar per a l'amplificació de PCR s'estableix segons diferents propòsits de recerca científica i proves clíniques.Després de fer un volum petit, com ara 20 ul, i després fer un volum més gran, heu de seguir les condicions, en cas contrari, fallarà fàcilment.Raons físiques: la desnaturalització és molt important per a l'amplificació per PCR.Si la temperatura de desnaturalització és baixa i el temps de desnaturalització és curt, és molt probable que es produeixin falsos negatius;la temperatura de recuit és massa baixa, cosa que pot provocar una amplificació inespecífica i reduir l'eficiència de l'amplificació específica.La temperatura de recuit és massa alta.Afecta molt la unió dels primers a les plantilles i redueix l'eficiència de l'amplificació de la PCR.De vegades és necessari utilitzar un termòmetre estàndard per comprovar les temperatures de desnaturalització, recuit i extensió a l'amplificador o olla soluble en aigua.Aquesta és també una de les raons del fracàs de la PCR.Variació de la seqüència diana: si la seqüència diana està mutada o eliminada, cosa que afecta la unió específica de l'encebador a la plantilla, o si l'encebador i la plantilla perden la seqüència complementària a causa de la supressió d'un determinat segment de la seqüència diana, l'amplificació per PCR. no tindrà èxit.
2.fals positiu La banda d'amplificació de PCR que apareix és coherent amb la banda de la seqüència objectiu, i de vegades la banda és més ordenada i més brillant.Disseny d'imprimació inadequat: la seqüència d'amplificació seleccionada té homologia amb la seqüència d'amplificació no objectiu, de manera que quan es realitza l'amplificació de PCR, el producte de PCR amplificat és una seqüència no objectiu.Si la seqüència diana és massa curta o l'encebador és massa curt, es poden produir fàcilment falsos positius.Els primers s'han de redissenyar.Contaminació creuada de seqüències diana o productes d'amplificació: hi ha dues raons per a aquesta contaminació: En primer lloc, contaminació creuada de tot el genoma o de fragments grans, que dóna lloc a falsos positius.Aquest fals positiu es pot resoldre amb els mètodes següents: Aneu amb compte i amb cura quan opereu per evitar que la seqüència objectiu sigui aspirada a la pistola de mostres o esquitxada fora del tub de la centrífuga.Excepte els enzims i les substàncies que no poden suportar altes temperatures, tots els reactius o equips s'han d'esterilitzar a alta pressió.Tots els tubs de centrífuga i les puntes de pipeta d'injecció de mostres s'han d'utilitzar una vegada.Si cal, els tubs de reacció i els reactius s'irradien amb llum ultraviolada abans d'afegir la mostra per destruir els àcids nucleics presents.El segon és la contaminació de petits fragments d'àcids nucleics a l'aire.Aquests petits fragments són més curts que la seqüència diana, però tenen una certa homologia.Es poden empalmar entre si i, després de ser complementaris als primers, els productes de PCR es poden amplificar, donant lloc a falsos positius, que es poden reduir o eliminar mitjançant mètodes de PCR imbricats.
3. Apareixen bandes d'amplificació no específiques Les bandes que apareixen després de l'amplificació per PCR són incompatibles amb la mida esperada, ja sigui més gran o més petita, o apareixen alhora bandes d'amplificació específiques i bandes d'amplificació no específiques.Els motius de l'aparició de bandes no específiques són: en primer lloc, els cebadors no són completament complementaris a la seqüència diana, o els cebadors s'agreguen per formar dímers.La segona raó és que la concentració d'ions Mg2 + és massa alta, la temperatura de recuit és massa baixa i el nombre de cicles de PCR és massa elevat.El segon factor és la qualitat i la quantitat de l'enzim.Els enzims d'algunes fonts sovint són propensos a bandes no específiques, però els enzims d'altres fonts no.De vegades, quantitats excessives d'enzims poden conduir a una amplificació inespecífica.Les contramesures inclouen: redissenyar les imprimacions si cal.Reduïu la quantitat d'enzim o substituïu-lo per una altra font.Reduïu la quantitat de primers, augmenteu la quantitat de plantilla adequadament i reduïu el nombre de cicles.Augmenteu la temperatura de recuit adequadament o utilitzeu el mètode de dos punts de temperatura (desnaturalització a 93 °C, recuit i extensió al voltant de 65 °C).
4.Apareixen arrossegaments o taques escamoses. L'amplificació de PCR de vegades apareix com a bandes untades, bandes semblants a làmines o bandes semblants a catifes.Els motius sovint són causats per massa enzim o mala qualitat de l'enzim, concentració de dNTP massa alta, concentració massa alta de Mg2+, temperatura de recuit massa baixa i massa cicles.Les contramesures inclouen: ① Reduir la quantitat d'enzim o substituir l'enzim per una altra font.②Redueix la concentració de dNTP.Reduir adequadament la concentració de Mg2+.Augmenta la quantitat de plantilles i redueix el nombre de cicles