PCR GYIK 1. Hamis negatív, nem jelenik meg amplifikációs sáv 2. Hamis pozitív 3. Nem specifikus amplifikációs sávok jelennek meg 4. Foltos húzócsíkok vagy kenetcsíkok jelennek meg:

1 Hamis negatív, nem jelenik meg amplifikált sáv A PCR reakció kulcsfontosságú szempontjai a következők

① templát nukleinsav előállítása

② primer minősége és specifikussága

③ enzimminőség és

④ PCR ciklus feltételei.Az okok felderítéséhez a fenti linkeken is érdemes elemzést és kutatást végezni.

Sablon:

① A templát szennyező fehérjéket tartalmaz

② A sablon Taq enzim inhibitorokat tartalmaz

③ A templátban lévő fehérjék nem emésztődnek meg és nem távolíthatók el, különösen a kromoszómák hisztonjai

④ Túl sok veszett a sablon extrahálása és előkészítése során, vagy fenolt lélegeztek be

⑤A templát nukleinsav nincs teljesen denaturálva.Ha az enzimek és primerek minősége jó, ha nem jelennek meg amplifikációs sávok, akkor nagy valószínűséggel a minta emésztési folyamatában vagy a templát nukleinsav extrakciós folyamatában van valami hiba.Ezért hatékony és stabil emésztőoldatot kell készíteni, és az eljárást rögzíteni kell, és nem szabad tetszőlegesen megváltoztatni..Enzim inaktiválás: Szükséges az új enzim cseréje, vagy a régi és az új enzimek egyidejű alkalmazása annak elemzésére, hogy az álnegatívumot az enzim elvesztése vagy elégtelen aktivitása okozza-e.Meg kell jegyezni, hogy néha elfelejtik a Taq enzimet. Primerek: A primer minősége, a primer koncentrációja és az, hogy a két primer koncentrációja szimmetrikus-e, gyakori oka a PCR sikertelenségének vagy a nem kielégítő amplifikációs sávoknak és a könnyű diffúziónak.Egyes tételekben problémák vannak a primer szintézis minőségével.A két primer közül az egyik magas, a másik alacsony koncentrációjú, ami alacsony hatásfokú aszimmetrikus amplifikációt eredményez.

Az ellenintézkedések a következők:

① Válasszon egy jó primer szintézis egységet.

② A primerek koncentrációja során nem csak az OD-értéket kell figyelembe venni, hanem az agaróz gélelektroforézishez használt primer törzsoldatot is.Alapozó sávoknak kell lenniük, és a két alapozó sáv fényerejének nagyjából azonosnak kell lennie.Például az egyik primernek van egy sávja, a másik primernek nincs sávja.A csíkok esetében a PCR jelenleg sikertelen lehet, és a primer szintézis egységgel való egyeztetés útján kell megoldani.Ha az egyik alapozónak nagy a fényessége, a másiknak alacsony a fényessége, egyensúlyozza ki a koncentrációkat az alapozók hígítása során.

③ Az alapozókat nagy koncentrációban és kis mennyiségben kell tárolni, hogy elkerüljük az ismételt fagyást és felengedést, illetve a hosszú távú hűtőszekrényben való tárolást, ami az alapozók károsodásához és lebomlásához vezethet.

④A primer tervezése nem ésszerű, például a primer hossza nem elegendő, a primerek között dimerek képződnek, stb. Mg2+ koncentráció: A Mg2+ ion koncentráció nagyban befolyásolja a PCR amplifikáció hatékonyságát.Ha a koncentráció túl magas, az csökkentheti a PCR-amplifikáció specificitását.Ha a koncentráció túl alacsony, az befolyásolja a PCR amplifikációs hozamot, és még azt is okozhatja, hogy a PCR amplifikáció meghiúsul amplifikációs sávok nélkül.Változások a reakciótérfogatban: Általában a PCR-amplifikációhoz használt térfogatok 20 ul, 30 ul és 50 ul.Vagy 100 ul, hogy a PCR amplifikációhoz milyen térfogatot kell használni, azt a tudományos kutatás és a klinikai tesztelés különböző céljai szerint állítják be.Kis mennyiség, például 20 ul, majd nagyobb térfogat készítése után be kell tartania a feltételeket, különben könnyen meghibásodik.Fizikai okok: A denaturáció nagyon fontos a PCR amplifikációhoz.Ha a denaturálási hőmérséklet alacsony és a denaturációs idő rövid, nagy valószínűséggel hamis negatívok fordulnak elő;a lágyítási hőmérséklet túl alacsony, ami nem specifikus erősítést okozhat, és csökkenti a fajlagos erősítés hatékonyságát.Az izzítási hőmérséklet túl magas.Erősen befolyásolja a primerek kötődését a templátokhoz, és csökkenti a PCR amplifikáció hatékonyságát.Néha szabványos hőmérővel kell ellenőrizni a denaturációs, lágyítási és kiterjesztési hőmérsékletet az erősítőben vagy a vízoldható edényben.Ez is az egyik oka a PCR sikertelenségének.Célszekvencia variáció: Ha a célszekvencia mutációja vagy deléciója, ami befolyásolja a primer specifikus kötődését a templáthoz, vagy a primer és a templát elveszti a komplementer szekvenciát a célszekvencia egy bizonyos szegmensének deléciója miatt, a PCR amplifikáció nem lesz sikeres.

2. téves pozitív A megjelenő PCR amplifikációs sáv összhangban van a célszekvencia sávjával, és néha a sáv rendezettebb és világosabb.Nem megfelelő primer tervezés: A kiválasztott amplifikációs szekvencia homológiát mutat a nem cél amplifikációs szekvenciával, így a PCR amplifikáció végrehajtásakor az amplifikált PCR termék nem célszekvencia.Ha a célszekvencia túl rövid, vagy a primer túl rövid, könnyen előfordulhat téves pozitív eredmény.Az alapozókat újra kell tervezni.Célszekvenciák vagy amplifikációs termékek keresztszennyeződése: Ennek a szennyeződésnek két oka van: Először is, a teljes genom vagy nagy fragmentumok keresztszennyeződése, ami téves pozitív eredményekhez vezet.Ez a téves pozitív eredmény a következő módszerekkel oldható meg: Legyen óvatos és kíméletes a művelet során, nehogy a célszekvencia beszívódjon a mintapisztolyba vagy kifröccsenjen a centrifugacsőből.Az enzimek és a magas hőmérsékletnek nem ellenálló anyagok kivételével minden reagenst vagy berendezést nagy nyomással kell sterilizálni.Minden centrifugacsövet és mintainjekciós pipettahegyet egyszer fel kell használni.Ha szükséges, a reakciócsöveket és a reagenseket ultraibolya fénnyel sugározzák be a minta hozzáadása előtt, hogy elpusztítsák a jelenlévő nukleinsavakat.A második a levegőben lévő kis nukleinsav-fragmensek szennyeződése.Ezek a kis fragmentumok rövidebbek, mint a célszekvencia, de bizonyos homológiát mutatnak.Ezek egymáshoz illeszthetők, majd a primerekkel komplementer PCR-termékek amplifikálhatók, téves pozitív eredményeket eredményezve, amelyek egymásba ágyazott PCR módszerekkel csökkenthetők vagy kiküszöbölhetők.

 

3.Nem specifikus amplifikációs sávok jelennek meg A PCR amplifikáció után megjelenő sávok nem konzisztensek a várt mérettel, akár nagyobbak, akár kisebbek, vagy a specifikus amplifikációs sávok és a nem specifikus amplifikációs sávok egyszerre jelennek meg.A nem specifikus sávok megjelenésének okai a következők: először is, a primerek nem teljesen komplementerek a célszekvenciával, vagy a primerek aggregálódnak dimerekké.A második ok az, hogy túl magas a Mg2+ ion koncentrációja, túl alacsony a lágyítási hőmérséklet, és túl magas a PCR ciklusok száma.A második tényező az enzim minősége és mennyisége.Az egyes forrásokból származó enzimek gyakran hajlamosak a nem specifikus sávokra, de a más forrásokból származó enzimek nem.Az enzimek túlzott mennyisége néha nem specifikus amplifikációhoz vezethet.Az ellenintézkedések közé tartozik: szükség esetén az alapozók újratervezése.Csökkentse az enzim mennyiségét, vagy cserélje ki más forrással.Csökkentse a primerek mennyiségét, növelje megfelelően a sablon mennyiségét, és csökkentse a ciklusok számát.Növelje megfelelően az izzítási hőmérsékletet, vagy használja a kéthőmérsékletpontos módszert (denaturálás 93 °C-on, lágyítás és nyújtás 65 °C körül).

 

4. Pelyhes húzódás vagy foltok jelennek meg. A PCR-amplifikáció néha elkenődött sávokként, lapszerű sávokként vagy szőnyegszerű csíkokként jelenik meg.Az okokat gyakran a túl sok enzim vagy az enzim rossz minősége, a túl magas dNTP-koncentráció, a túl magas Mg2+-koncentráció, a túl alacsony hőkezelési hőmérséklet és a túl sok ciklus okozza.Az ellenintézkedések a következők: ① Csökkentse az enzim mennyiségét, vagy cserélje ki az enzimet más forrással.② Csökkentse a dNTP koncentrációját.Csökkentse megfelelően a Mg2+ koncentrációt.Növelje a sablonok számát és csökkentse a ciklusok számát