PCR FAQ 1. Negativ i rremë, nuk shfaqet brezi amplifikimi 2. False pozitiv 3. Shfaqen breza jospecifik amplifikimi 4. Shfaqen shirita tërheqjeje ose shirita njollosje:
1 Negativ i rremë, nuk shfaqet brezi i përforcuar Aspektet kryesore të reagimit PCR janë
① përgatitja e shabllonit të acidit nukleik
② cilësia dhe specifika e abetareve
③ cilësinë e enzimës dhe
④ kushtet e ciklit PCR.Për të gjetur arsyet, analiza dhe kërkime duhet të kryhen edhe në lidhjet e mësipërme.
Modeli:
① Shablloni përmban proteina papastërti
② Shablloni përmban frenues të enzimës Taq
③ Proteinat në shabllon nuk treten dhe hiqen, veçanërisht histonet në kromozome
④ Humbi shumë gjatë nxjerrjes dhe përgatitjes së shabllonit, ose u thith fenoli
⑤Acidi nukleik i shabllonit nuk është denatyruar plotësisht.Kur cilësia e enzimave dhe abetareve është e mirë, nëse brezat e amplifikimit nuk shfaqen, ka shumë të ngjarë që të ketë diçka të gabuar me procesin e tretjes së kampionit ose me procesin e nxjerrjes së acidit nukleik të shabllonit.Prandaj, duhet të përgatitet një zgjidhje efektive dhe e qëndrueshme e tretjes, dhe procedura duhet të rregullohet dhe nuk duhet të ndryshohet sipas dëshirës..Inaktivizimi i enzimës: Është e nevojshme të zëvendësohet enzima e re, ose të përdoren enzimat e vjetra dhe të reja në të njëjtën kohë për të analizuar nëse negativët fals shkaktohen nga humbja ose aktiviteti i pamjaftueshëm i enzimës.Duhet të theksohet se ndonjëherë harrohet enzima Taq. Primerët: Cilësia e primerit, përqendrimi i primerit dhe nëse përqendrimet e dy primerëve janë simetrike janë arsye të zakonshme për dështimin e PCR ose brezat e pakënaqshëm të amplifikimit dhe difuzionin e lehtë.Ka probleme me cilësinë e sintezës së primerit në disa grupe.Njëri nga dy primerët ka një përqendrim të lartë dhe tjetri ka një përqendrim të ulët, duke rezultuar në amplifikimin asimetrik me efikasitet të ulët.
Kundërmasat janë:
① Zgjidhni një njësi të mirë të sintezës së primerit.
② Përqendrimi i abetareve jo vetëm që duhet të shikojë vlerën e OD, por gjithashtu duhet t'i kushtojë vëmendje zgjidhjes së stokut të primerit për elektroforezën e xhelit të agarozës.Duhet të ketë breza primer, dhe shkëlqimi i dy brezave të primerit duhet të jetë afërsisht i njëjtë.Për shembull, një abetare ka një brez dhe abetarja tjetër nuk ka brez.Për shiritat, PCR mund të dështojë në këtë moment dhe duhet të zgjidhet përmes negocimit me njësinë e sintezës së primerit.Nëse një abetare ka ndriçim të lartë dhe tjetri ka ndriçim të ulët, balanconi përqendrimet kur holloni primerët.
③ Primerët duhet të ruhen në përqendrim të lartë dhe në sasi të vogla për të parandaluar ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur ose ruajtjen afatgjatë në frigorifer, gjë që mund të çojë në përkeqësim dhe degradim të primerëve.
④ Dizajni i primerit është i paarsyeshëm, për shembull, gjatësia e primerit nuk është e mjaftueshme, dimerët formohen midis primerëve, etj. Përqendrimi i Mg2+: Përqendrimi i joneve Mg2+ ka një ndikim të madh në efikasitetin e amplifikimit të PCR.Nëse përqendrimi është shumë i lartë, mund të zvogëlojë specifikën e amplifikimit të PCR.Nëse përqendrimi është shumë i ulët, kjo do të ndikojë në rendimentin e amplifikimit PCR dhe madje do të shkaktojë dështimin e amplifikimit të PCR pa amplifikimin e brezave.Ndryshimet në vëllimin e reaksionit: Zakonisht vëllimet e përdorura për amplifikimin e PCR janë 20ul, 30ul dhe 50ul.Ose 100ul, çfarë vëllimi duhet të përdoret për amplifikimin e PCR përcaktohet sipas qëllimeve të ndryshme të kërkimit shkencor dhe testimit klinik.Pasi të keni bërë një vëllim të vogël, si p.sh. 20ul, dhe më pas të bëni një vëllim më të madh, duhet të ndiqni kushtet, përndryshe do të dështojë lehtësisht.Arsyet fizike: Denatyrimi është shumë i rëndësishëm për amplifikimin e PCR.Nëse temperatura e denatyrimit është e ulët dhe koha e denatyrimit është e shkurtër, ka shumë gjasa të ndodhin negativë të rremë;temperatura e pjekjes është shumë e ulët, gjë që mund të shkaktojë përforcim jo specifik dhe të zvogëlojë efikasitetin specifik të amplifikimit.Temperatura e pjekjes është shumë e lartë.Ndikon shumë në lidhjen e primerëve me shabllonet dhe redukton efikasitetin e amplifikimit të PCR.Ndonjëherë është e nevojshme të përdoret një termometër standard për të kontrolluar temperaturat e denatyrimit, pjekjes dhe zgjatjes në amplifikator ose tenxhere të tretshme në ujë.Kjo është gjithashtu një nga arsyet e dështimit të PCR.Variacioni i sekuencës së synuar: Nëse sekuenca e synuar mutohet ose fshihet, gjë që ndikon në lidhjen specifike të primerit me shabllonin, ose primeri dhe shablloni humbin sekuencën plotësuese për shkak të fshirjes së një segmenti të caktuar të sekuencës së synuar, amplifikimi i PCR nuk do të ketë sukses.
2.false pozitive Brezi i amplifikimit PCR që shfaqet është në përputhje me brezin e sekuencës së synuar, dhe ndonjëherë brezi është më i rregullt dhe më i ndritshëm.Dizajni i papërshtatshëm i primerit: Sekuenca e përzgjedhur e amplifikimit ka homologji me sekuencën e amplifikimit jo të synuar, kështu që gjatë kryerjes së amplifikimit PCR, produkti i përforcuar PCR është një sekuencë jo objektiv.Nëse sekuenca e synuar është shumë e shkurtër ose abetarja është shumë e shkurtër, mund të shfaqen lehtësisht rezultate false.Primerat duhet të ridizajnohen.Kontaminimi i kryqëzuar i sekuencave të synuara ose produkteve të amplifikimit: Ka dy arsye për këtë kontaminim: Së pari, kontaminim i tërthortë i të gjithë gjenomit ose i fragmenteve të mëdha, që çon në pozitive të rreme.Ky pozitiv i rremë mund të zgjidhet me metodat e mëposhtme: Jini të kujdesshëm dhe të butë kur veproni për të parandaluar që sekuenca e synuar të thithet në pistoletën e mostrës ose të spërkatet nga tubi i centrifugës.Përveç enzimave dhe substancave që nuk mund t'i rezistojnë temperaturave të larta, të gjithë reagentët ose pajisjet duhet të sterilizohen me presion të lartë.Të gjithë tubat e centrifugës dhe majat e pipetës së injektimit të mostrës duhet të përdoren një herë.Nëse është e nevojshme, tubat e reaksionit dhe reagentët rrezatohen me dritë ultravjollcë përpara se të shtohet mostra për të shkatërruar acidet nukleike të pranishme.E dyta është ndotja e fragmenteve të vogla të acideve nukleike në ajër.Këto fragmente të vogla janë më të shkurtra se sekuenca e synuar, por kanë një homologji të caktuar.Ato mund të bashkohen me njëra-tjetrën dhe pasi të jenë plotësuese me primerët, produktet PCR mund të amplifikohen, duke rezultuar në pozitive false, të cilat mund të reduktohen ose eliminohen me metodat e mbivendosura PCR.
3. Shfaqen brezat e amplifikimit jo-specifik Brezat që shfaqen pas amplifikimit PCR nuk janë në përputhje me madhësinë e pritur, ose më të mëdha ose më të vogla, ose të dy brezat e amplifikimit specifik dhe brezat e amplifikimit jospecifik shfaqen në të njëjtën kohë.Arsyet për shfaqjen e brezave jospecifik janë: së pari, abetaret nuk janë plotësisht komplementare me sekuencën e synuar, ose abetaret grumbullohen për të formuar dimerë.Arsyeja e dytë është se përqendrimi i joneve Mg2+ është shumë i lartë, temperatura e pjekjes është shumë e ulët dhe numri i cikleve PCR është shumë i lartë.Faktori i dytë është cilësia dhe sasia e enzimës.Enzimat nga disa burime shpesh janë të prirura ndaj brezave jo specifikë, por enzimat nga burime të tjera jo.Sasitë e tepërta të enzimave ndonjëherë mund të çojnë në përforcim jospecifik.Kundërmasat përfshijnë: ridizajnimin e abetareve nëse është e nevojshme.Zvogëloni sasinë e enzimës ose zëvendësoni atë me një burim tjetër.Zvogëloni sasinë e abetareve, rrisni sasinë e shabllonit në mënyrë të përshtatshme dhe zvogëloni numrin e cikleve.Rriteni temperaturën e pjekjes në mënyrë të përshtatshme ose përdorni metodën e pikave me dy temperatura (denatyrimi në 93°C, pjekja dhe zgjatja rreth 65°C).
4. Shfaqen zvarritje ose njolla të kripura Përforcimi i PCR ndonjëherë shfaqet si shirita të lyer, shirita fletësh ose shirita të ngjashëm me tapetin.Arsyet shpesh shkaktohen nga shumë enzima ose cilësia e dobët e enzimës, përqendrimi shumë i lartë i dNTP, përqendrimi shumë i lartë i Mg2+, temperatura shumë e ulët e pjekjes dhe shumë cikle.Kundërmasat përfshijnë: ① Zvogëloni sasinë e enzimës ose zëvendësoni enzimën me një burim tjetër.②Zvogëloni përqendrimin e dNTP.Reduktoni në mënyrë të përshtatshme përqendrimin e Mg2+.Rritni sasinë e shablloneve dhe zvogëloni numrin e cikleve