PCR FAQ 1. Falsk negativ, ingen amplifikationsbånd vises 2. Falsk positiv 3. Uspecifikke amplifikationsbånd vises 4. Flaky drag strips eller smear strips vises:
1Falsk negativ, intet amplificeret bånd vises. De vigtigste aspekter af PCR-reaktionen er
① fremstilling af skabelonnukleinsyre
② primer kvalitet og specificitet
③ enzym kvalitet og
④ PCR-cyklusbetingelser.For at finde årsagerne bør der også udføres analyser og forskning på ovenstående links.
Skabelon:
① Skabelonen indeholder urenhedsproteiner
② Skabelonen indeholder Taq-enzymhæmmere
③ Proteinerne i skabelonen fordøjes og fjernes ikke, især histonerne i kromosomerne
④ For meget gik tabt under ekstraktion og klargøring af skabelonen, eller phenol blev inhaleret
⑤Skabelonnukleinsyren er ikke fuldstændig denatureret.Når kvaliteten af enzymer og primere er god, hvis amplifikationsbånd ikke vises, er det højst sandsynligt, at der er noget galt med fordøjelsesprocessen af prøven eller skabelonnukleinsyreekstraktionsprocessen.Derfor skal der fremstilles en effektiv og stabil fordøjelsesopløsning, og proceduren skal fastlægges og bør ikke ændres efter behag..Enzyminaktivering: Det er nødvendigt at erstatte det nye enzym, eller bruge både gamle og nye enzymer på samme tid for at analysere, om falske negativer er forårsaget af tab eller utilstrækkelig enzymaktivitet.Det skal bemærkes, at nogle gange glemmes Taq-enzymet. Primere: Primerkvalitet, primerkoncentration og om koncentrationerne af de to primere er symmetriske er almindelige årsager til PCR-svigt eller utilfredsstillende amplifikationsbånd og let diffusion.Der er problemer med kvaliteten af primersyntese i nogle batches.En af de to primere har en høj koncentration, og den anden har en lav koncentration, hvilket resulterer i laveffektiv asymmetrisk amplifikation.
Modforanstaltningerne er:
① Vælg en god primersynteseenhed.
② Koncentrationen af primere skal ikke kun se på OD-værdien, men også være opmærksom på primerstamopløsningen til agarosegelelektroforese.Der skal være primerbånd, og lysstyrken af de to primerbånd skal være nogenlunde den samme.For eksempel har en primer et bånd, og den anden primer har intet bånd.For strimler kan PCR mislykkes på dette tidspunkt og bør løses gennem forhandling med primersynteseenheden.Hvis den ene primer har høj lysstyrke, og den anden har lav lysstyrke, skal du afbalancere koncentrationerne ved fortynding af primerne.
③ Primere bør opbevares i høj koncentration og små mængder for at forhindre gentagen frysning og optøning eller langtidsopbevaring i køleskabet, hvilket kan føre til forringelse og nedbrydning af primerne.
④Primerdesignet er urimeligt, såsom primerlængden er ikke nok, dimerer dannes mellem primere osv. Mg2+-koncentration: Mg2+-ionkoncentration har stor indflydelse på PCR-amplifikationseffektiviteten.Hvis koncentrationen er for høj, kan det reducere specificiteten af PCR-amplifikation.Hvis koncentrationen er for lav, vil det påvirke PCR-amplifikationsudbyttet og endda få PCR-amplifikationen til at mislykkes uden amplifikationsbånd.Ændringer i reaktionsvolumen: Normalt er de volumener, der bruges til PCR-amplifikation, 20 ul, 30 ul og 50 ul.Eller 100 ul, hvilket volumen der skal bruges til PCR-amplifikation er indstillet i henhold til forskellige formål med videnskabelig forskning og klinisk testning.Efter at have lavet et lille volumen, såsom 20ul, og derefter lavet et større volumen, skal du følge betingelserne, ellers vil det let fejle.Fysiske årsager: Denaturering er meget vigtig for PCR-amplifikation.Hvis denatureringstemperaturen er lav, og denatureringstiden er kort, er der meget sandsynlighed for, at falske negativer forekommer;annealingstemperaturen er for lav, hvilket kan forårsage uspecifik amplifikation og reducere den specifikke amplifikationseffektivitet.Udglødningstemperaturen er for høj.Påvirker i høj grad bindingen af primere til skabeloner og reducerer PCR-amplifikationseffektiviteten.Nogle gange er det nødvendigt at bruge et standardtermometer til at kontrollere denaturerings-, udglødnings- og forlængelsestemperaturerne i forstærkeren eller den vandopløselige gryde.Dette er også en af årsagerne til PCR-fejl.Målsekvensvariation: Hvis målsekvensen er muteret eller deleteret, hvilket påvirker den specifikke binding af primeren til templaten, eller hvis primeren og templaten mister den komplementære sekvens på grund af deletionen af et bestemt segment af målsekvensen, vil PCR-amplifikationen vil ikke lykkes.
2. Falsk positiv PCR-amplifikationsbåndet, der vises, stemmer overens med målsekvensbåndet, og nogle gange er båndet mere ordnet og lysere.Uhensigtsmæssigt primerdesign: Den valgte amplifikationssekvens har homologi med ikke-mål-amplifikationssekvensen, så når der udføres PCR-amplifikation, er det amplificerede PCR-produkt en ikke-målsekvens.Hvis målsekvensen er for kort, eller primeren er for kort, kan der let opstå falske positiver.Primere skal redesignes.Krydskontaminering af målsekvenser eller amplifikationsprodukter: Der er to årsager til denne kontaminering: For det første krydskontaminering af hele genomet eller store fragmenter, hvilket fører til falske positiver.Denne falske positiv kan løses ved hjælp af følgende metoder: Vær forsigtig og skånsom under drift for at forhindre, at målsekvensen suges ind i prøvepistolen eller sprøjtes ud af centrifugerøret.Bortset fra enzymer og stoffer, der ikke kan modstå høje temperaturer, bør alle reagenser eller udstyr steriliseres ved højtryk.Alle centrifugerør og prøveinjektionspipettespidser skal bruges én gang.Om nødvendigt bestråles reaktionsrørene og reagenserne med ultraviolet lys, før prøven tilsættes for at ødelægge de tilstedeværende nukleinsyrer.Den anden er forurening af små fragmenter af nukleinsyrer i luften.Disse små fragmenter er kortere end målsekvensen, men har en vis homologi.De kan splejses til hinanden, og efter at være komplementære til primerne kan PCR-produkterne amplificeres, hvilket resulterer i falske positive, som kan reduceres eller elimineres ved indlejrede PCR-metoder.
3. Ikke-specifikke amplifikationsbånd vises De bånd, der vises efter PCR-amplifikation, er inkonsistente med den forventede størrelse, enten større eller mindre, eller både specifikke amplifikationsbånd og ikke-specifikke amplifikationsbånd vises på samme tid.Årsagerne til fremkomsten af ikke-specifikke bånd er: for det første er primerne ikke fuldstændig komplementære til målsekvensen, eller primerne aggregerer til dannelse af dimerer.Den anden grund er, at Mg2+-ionkoncentrationen er for høj, annealingstemperaturen er for lav, og antallet af PCR-cyklusser er for højt.Den anden faktor er kvaliteten og mængden af enzymet.Enzymer fra nogle kilder er ofte tilbøjelige til ikke-specifikke bånd, men enzymer fra andre kilder gør det ikke.For store mængder af enzymer kan nogle gange føre til uspecifik amplifikation.Modforanstaltningerne omfatter: redesign primere om nødvendigt.Reducer mængden af enzym eller erstat det med en anden kilde.Reducer mængden af primere, øg mængden af skabelon passende, og reducer antallet af cyklusser.Forøg annealingstemperaturen på passende vis, eller brug to-temperaturpunktmetoden (denaturering ved 93°C, annealing og forlængelse omkring 65°C).
4. Flaky træk eller udtværinger forekommer PCR-amplifikation vises nogle gange som udtværede bånd, arklignende bånd eller tæppelignende bånd.Årsagerne er ofte forårsaget af for meget enzym eller dårlig kvalitet af enzymet, for høj dNTP-koncentration, for høj Mg2+-koncentration, for lav annealingstemperatur og for mange cyklusser.Modforanstaltningerne omfatter: ① Reducer mængden af enzym, eller udskift enzymet med en anden kilde.②Reducer koncentrationen af dNTP.Reducer Mg2+-koncentrationen passende.Øg mængden af skabeloner og reducer antallet af cyklusser