PCR ՀՏՀ 1. Կեղծ բացասական, ուժեղացման գոտի չի հայտնվում 2. Կեղծ դրական 3. Ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիներ են հայտնվում 4. հայտնվում են շերտավոր ձգող շերտեր կամ քսման շերտեր.

1 Կեղծ բացասական, ուժեղացված գոտի չի հայտնվում ՊՇՌ ռեակցիայի հիմնական կողմերն են

① կաղապարի նուկլեինաթթվի պատրաստում

② այբբենարանի որակը և առանձնահատկությունը

③ ֆերմենտի որակը և

④ PCR ցիկլի պայմանները:Պատճառները գտնելու համար վերլուծություններ և հետազոտություններ պետք է կատարվեն նաև վերը նշված հղումներով։

Կաղապար:

① Կաղապարը պարունակում է կեղտոտ սպիտակուցներ

② Կաղապարը պարունակում է Taq ֆերմենտի ինհիբիտորներ

③ Կաղապարի սպիտակուցները չեն մարսվում և հեռացվում, հատկապես քրոմոսոմների հիստոնները

④ Կաղապարի արդյունահանման և պատրաստման ընթացքում շատ բան է կորել, կամ ֆենոլ է ներշնչվել

⑤ Կաղապարի նուկլեինաթթուն ամբողջությամբ դենատուրացված չէ:Երբ ֆերմենտների և պրայմերների որակը լավ է, եթե ուժեղացման գոտիները չեն երևում, ամենայն հավանականությամբ, ինչ-որ բան այն չէ նմուշի մարսողության կամ կաղապարի նուկլեինաթթվի արդյունահանման գործընթացում:Ուստի պետք է պատրաստել արդյունավետ և կայուն մարսողության լուծույթ, իսկ պրոցեդուրան պետք է ֆիքսել և ըստ ցանկության չփոխել։.Ֆերմենտի ապաակտիվացում. անհրաժեշտ է փոխարինել նոր ֆերմենտը կամ միաժամանակ օգտագործել ինչպես հին, այնպես էլ նոր ֆերմենտները՝ վերլուծելու համար, թե արդյոք կեղծ բացասականները առաջանում են կորստի կամ ֆերմենտի անբավարար ակտիվության հետևանքով:Պետք է նշել, որ երբեմն մոռացվում է Taq ֆերմենտը: Պրայմերներ. պրայմերների որակը, պրայմերների կոնցենտրացիան և արդյոք երկու պրայմերների կոնցենտրացիաների սիմետրիկ լինելը PCR-ի ձախողման կամ անբավարար ուժեղացման գոտիների և հեշտ տարածման ընդհանուր պատճառներ են:Որոշ խմբաքանակներում այբբենարանի սինթեզի որակի հետ կապված խնդիրներ կան:Երկու այբբենարաններից մեկն ունի բարձր կոնցենտրացիա, իսկ մյուսը՝ ցածր, ինչը հանգեցնում է ցածր արդյունավետության ասիմետրիկ ուժեղացման:

Հակադարձ միջոցներն են.

① Ընտրեք լավ այբբենարանի սինթեզի միավոր:

② Պրայմերների կոնցենտրացիան ոչ միայն պետք է դիտարկի OD-ի արժեքը, այլև ուշադրություն դարձնի ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզի պրայմերային լուծույթին:Պետք է լինեն այբբենարանի շերտեր, և երկու այբբենարանների պայծառությունը պետք է մոտավորապես նույնը լինի:Օրինակ, մի այբբենարան ունի ժապավեն, իսկ մյուս այբբենարանը չունի ժապավեն:Շերտերի դեպքում PCR-ն այս պահին կարող է ձախողվել և պետք է լուծվի պրայմերների սինթեզի միավորի հետ բանակցությունների միջոցով:Եթե ​​մի այբբենարան ունի բարձր պայծառություն, իսկ մյուսը ցածր պայծառություն, հավասարակշռեք կոնցենտրացիաները պրայմերները նոսրացնելիս:

③ Այբբենարանները պետք է պահվեն բարձր կոնցենտրացիաներում և փոքր քանակությամբ՝ կանխելու կրկնակի սառեցումը և հալեցումը կամ երկարաժամկետ պահպանումը սառնարանում, ինչը կարող է հանգեցնել պրայմերների քայքայման և քայքայման:

④ Այբբենարանի ձևավորումն անհիմն է, օրինակ՝ այբբենարանի երկարությունը բավարար չէ, պրայմերների միջև ձևավորվում են դիմերներ և այլն: Mg2+ կոնցենտրացիան. Mg2+ իոնի կոնցենտրացիան մեծ ազդեցություն ունի PCR ուժեղացման արդյունավետության վրա:Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, դա կարող է նվազեցնել PCR ուժեղացման առանձնահատկությունը:Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, դա կազդի PCR ուժեղացման ելքի վրա և նույնիսկ կհանգեցնի PCR ուժեղացման ձախողմանը, առանց ուժեղացման գոտիների:Ռեակցիայի ծավալի փոփոխություններ. Սովորաբար PCR ամպլիֆիկացիայի համար օգտագործվող ծավալներն են 20ուլ, 30ուլ և 50ուլլ:Կամ 100ուլ, թե ինչ ծավալ պետք է օգտագործվի ՊՇՌ ուժեղացման համար, սահմանվում է ըստ գիտական ​​հետազոտությունների և կլինիկական փորձարկման տարբեր նպատակների:Փոքր ծավալ պատրաստելուց հետո, օրինակ՝ 20ուլ, իսկ հետո ավելի մեծ ծավալ պատրաստելուց հետո պետք է հետևել պայմաններին, հակառակ դեպքում այն ​​հեշտությամբ կձախողվի։Ֆիզիկական պատճառներ. Դենատուրացիան շատ կարևոր է PCR ամպլիֆիկացիայի համար:Եթե ​​դենատուրացիայի ջերմաստիճանը ցածր է, իսկ դենատուրացիայի ժամանակը կարճ է, ապա շատ հավանական է, որ տեղի ունենան կեղծ բացասականներ.եռացման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է, ինչը կարող է առաջացնել ոչ հատուկ ուժեղացում և նվազեցնել հատուկ ուժեղացման արդյունավետությունը:Հալման ջերմաստիճանը չափազանց բարձր է:Մեծապես ազդում է պրայմերների կաղապարներին կապելու վրա և նվազեցնում PCR ուժեղացման արդյունավետությունը:Երբեմն անհրաժեշտ է օգտագործել ստանդարտ ջերմաչափ՝ ուժեղացուցիչի կամ ջրում լուծվող կաթսայի դենատուրացիայի, կռելու և երկարացման ջերմաստիճանները ստուգելու համար:Սա նաև PCR-ի ձախողման պատճառներից մեկն է:Թիրախային հաջորդականության փոփոխություն. Եթե թիրախային հաջորդականությունը մուտացիայի է ենթարկվել կամ ջնջվել է, ինչը ազդում է այբբենարանի հատուկ կապակցման վրա կաղապարին, կամ այբբենարանն ու ձևանմուշը կորցնում են լրացուցիչ հաջորդականությունը՝ նպատակային հաջորդականության որոշակի հատվածի ջնջման պատճառով, PCR ուժեղացումը: հաջողություն չի ունենա.

2.կեղծ դրական ՊՇՌ ուժեղացման գոտին, որը հայտնվում է, համահունչ է թիրախային հաջորդականության շերտին, և երբեմն գոտին ավելի կանոնավոր և պայծառ է:Անհամապատասխան այբբենարանի ձևավորում. Ընտրված ուժեղացման հաջորդականությունը հոմոլոգիա ունի ոչ նպատակային ուժեղացման հաջորդականության հետ, ուստի PCR ուժեղացում կատարելիս ուժեղացված PCR արտադրանքը ոչ նպատակային հաջորդականություն է:Եթե ​​թիրախային հաջորդականությունը չափազանց կարճ է կամ այբբենարանը չափազանց կարճ է, ապա հեշտությամբ կարող են առաջանալ կեղծ դրական արդյունքներ:Այբբենարանները պետք է վերանախագծվեն:Թիրախային հաջորդականությունների կամ ուժեղացման արտադրանքների խաչաձև աղտոտում. Այս աղտոտման երկու պատճառ կա.Այս կեղծ դրականը կարող է լուծվել հետևյալ մեթոդներով. Եղեք զգույշ և նրբանկատորեն աշխատելիս, որպեսզի կանխեք թիրախային հաջորդականությունը նմուշառման ատրճանակի մեջ կամ դուրս շաղ տալ ցենտրիֆուգի խողովակից:Բացառությամբ ֆերմենտների և նյութերի, որոնք չեն կարող դիմակայել բարձր ջերմաստիճաններին, բոլոր ռեակտիվները կամ սարքավորումները պետք է ստերիլիզացվեն բարձր ճնշման միջոցով:Բոլոր ցենտրիֆուգային խողովակները և նմուշի ներարկման պիպետտի ծայրերը պետք է օգտագործվեն մեկ անգամ:Անհրաժեշտության դեպքում, ռեակցիայի խողովակները և ռեակտիվները ճառագայթվում են ուլտրամանուշակագույն լույսով, նախքան նմուշը ավելացնելը, որպեսզի ոչնչացնեն առկա նուկլեինաթթուները:Երկրորդը օդում նուկլեինաթթուների փոքր բեկորների աղտոտումն է։Այս փոքր բեկորներն ավելի կարճ են, քան թիրախային հաջորդականությունը, բայց ունեն որոշակի հոմոոլոգիա։Նրանք կարող են զուգակցվել միմյանց հետ, և պրայմերներին փոխլրացնելուց հետո PCR արտադրանքները կարող են ուժեղացվել, ինչը հանգեցնում է կեղծ դրական արդյունքների, որոնք կարող են կրճատվել կամ վերացվել ներկառուցված PCR մեթոդներով:

 

3. Հայտնվում են ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիներ Այն շերտերը, որոնք հայտնվում են PCR ուժեղացումից հետո, անհամապատասխան են ակնկալվող չափերին՝ ավելի մեծ կամ փոքր, կամ միաժամանակ հայտնվում են և՛ հատուկ ուժեղացման, և՛ ոչ հատուկ ուժեղացման գոտիները:Ոչ սպեցիֆիկ շերտերի առաջացման պատճառներն են՝ նախ՝ այբբենարաններն ամբողջությամբ չեն փոխլրացնում թիրախային հաջորդականությունը, կամ այբբենարանները միավորվում են՝ ձևավորելով դիմերներ։Երկրորդ պատճառն այն է, որ Mg2+ իոնների կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, եռացման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է, և PCR ցիկլերի քանակը չափազանց մեծ է:Երկրորդ գործոնը ֆերմենտի որակն ու քանակն է։Որոշ աղբյուրների ֆերմենտները հաճախ հակված են ոչ սպեցիֆիկ շերտերի, բայց այլ աղբյուրների ֆերմենտները՝ ոչ:Ֆերմենտների չափազանց մեծ քանակությունը երբեմն կարող է հանգեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման:Հակազդող միջոցները ներառում են. անհրաժեշտության դեպքում վերանախագծել այբբենարաններ:Նվազեցրեք ֆերմենտի քանակը կամ փոխարինեք այն այլ աղբյուրով:Կրճատեք պրայմերների քանակը, համապատասխան կերպով ավելացրեք կաղապարի քանակը և կրճատեք ցիկլերի քանակը:Համապատասխան կերպով բարձրացրեք հալման ջերմաստիճանը կամ օգտագործեք երկու ջերմաստիճանի կետի մեթոդը (դենատուրացիա 93°C-ում, հալում և երկարացում մոտ 65°C):

 

4. Շերտավոր ձգում կամ քսուքներ են հայտնվում PCR ուժեղացումը երբեմն հայտնվում է որպես քսված ժապավեններ, թերթանման ժապավեններ կամ գորգի նման ժապավեններ:Պատճառները հաճախ պայմանավորված են ֆերմենտի չափից շատ կամ ֆերմենտի վատ որակի, dNTP-ի չափազանց բարձր կոնցենտրացիայի, շատ բարձր Mg2+ կոնցենտրացիայի, եռացման չափազանց ցածր ջերմաստիճանի և չափազանց շատ ցիկլերի պատճառով:Հակազդող միջոցները ներառում են. ① Կրճատել ֆերմենտի քանակը կամ փոխարինել ֆերմենտը այլ աղբյուրով:②Նվազեցրեք dNTP-ի կոնցենտրացիան:Համապատասխանաբար նվազեցնել Mg2+ կոնցենտրացիան:Բարձրացրեք կաղապարների քանակը և կրճատեք ցիկլերի քանակը