PCR FAQ 1. Lažno negativan, ne pojavljuje se traka pojačanja 2. Lažno pozitivno 3. Pojavljuju se nespecifične trake pojačanja 4. Pojavljuju se ljuspičaste trake za povlačenje ili mrlje:
1Lažno negativno, ne pojavljuje se pojačana traka. Ključni aspekti PCR reakcije su
① priprema šablonske nukleinske kiseline
② kvalitetu i specifičnost primera
③ kvaliteta enzima i
④ Uvjeti PCR ciklusa.Da bi se pronašli razlozi, također treba provesti analizu i istraživanje na gornjim poveznicama.
Predložak:
① Predložak sadrži proteine nečistoće
② Predložak sadrži inhibitore enzima Taq
③ Proteini u predlošku se ne probavljaju i ne uklanjaju, osobito histoni u kromosomima
④ Previše je izgubljeno tijekom ekstrakcije i pripreme predloška ili je fenol udisan
⑤Nukleinska kiselina uzorka nije potpuno denaturirana.Kada je kvaliteta enzima i početnica dobra, ako se trake pojačanja ne pojave, najvjerojatnije je da nešto nije u redu s procesom probave uzorka ili procesom ekstrakcije nukleinske kiseline uzorka.Stoga se mora pripremiti učinkovita i stabilna otopina za probavu, a postupak treba fiksirati i ne mijenjati po želji..Inaktivacija enzima: Potrebno je zamijeniti novi enzim ili koristiti stare i nove enzime u isto vrijeme kako bi se analiziralo jesu li lažno negativni rezultati uzrokovani gubitkom ili nedovoljnom enzimskom aktivnošću.Treba napomenuti da se ponekad Taq enzim zaboravi. Primeri: Kvaliteta primera, koncentracija primera i jesu li koncentracije dvaju primera simetrične uobičajeni su razlozi za neuspjeh PCR-a ili nezadovoljavajuće trake pojačanja i laku difuziju.Postoje problemi s kvalitetom sinteze primera u nekim serijama.Jedan od dva primera ima visoku koncentraciju, a drugi ima nisku koncentraciju, što rezultira niskoučinkovitim asimetričnim pojačavanjem.
Protumjere su:
① Odaberite dobru jedinicu za sintezu primera.
② Koncentracija primera ne treba promatrati samo vrijednost OD, već također treba obratiti pozornost na temeljnu otopinu primera za elektroforezu u agaroznom gelu.Moraju postojati trake temeljnog premaza, a svjetlina dviju traka temeljnog premaza trebala bi biti otprilike ista.Na primjer, jedan primer ima traku, a drugi nema traku.Za trake, PCR može biti neuspješan u ovom trenutku i trebao bi se riješiti pregovorima s jedinicom za sintezu primera.Ako jedan primer ima visoku svjetlinu, a drugi nisku svjetlinu, uravnotežite koncentracije prilikom razrjeđivanja primera.
③ Primere treba čuvati u visokim koncentracijama i malim količinama kako bi se spriječilo ponovno smrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno skladištenje u hladnjaku, što može dovesti do kvarenja i degradacije primera.
④Dizajn primera je nerazuman, kao što je duljina primera nedovoljna, dimeri se stvaraju između primera, itd. Koncentracija Mg2+: Koncentracija iona Mg2+ ima veliki utjecaj na učinkovitost PCR amplifikacije.Ako je koncentracija previsoka, može smanjiti specifičnost PCR amplifikacije.Ako je koncentracija preniska, to će utjecati na prinos PCR amplifikacije i čak uzrokovati neuspjeh PCR amplifikacije bez pojačanja vrpci.Promjene u reakcijskom volumenu: Obično su volumeni koji se koriste za PCR amplificiranje 20 ul, 30 ul i 50 ul.Ili 100 ul, koji se volumen treba koristiti za PCR amplificiranje postavlja se prema različitim svrhama znanstvenog istraživanja i kliničkog ispitivanja.Nakon što napravite mali volumen, kao što je 20 ul, a zatim napravite veći volumen, morate slijediti uvjete, inače će lako pokvariti.Fizički razlozi: Denaturacija je vrlo važna za PCR pojačanje.Ako je temperatura denaturacije niska, a vrijeme denaturacije kratko, vrlo je vjerojatno da će doći do lažno negativnih rezultata;temperatura žarenja je preniska, što može uzrokovati nespecifično pojačanje i smanjiti učinkovitost specifičnog pojačanja.Temperatura žarenja je previsoka.Jako utječe na vezanje početnica na predloške i smanjuje učinkovitost PCR amplifikacije.Ponekad je potrebno upotrijebiti standardni termometar za provjeru temperatura denaturacije, žarenja i ekstenzije u pojačivaču ili posudi topljivoj u vodi.To je također jedan od razloga neuspjeha PCR-a.Varijacija ciljne sekvence: Ako je ciljna sekvenca mutirana ili izbrisana, što utječe na specifično vezanje početnice na predložak, ili početnica i predložak izgube komplementarnu sekvencu zbog brisanja određenog segmenta ciljne sekvence, PCR amplifikacija neće biti uspješna.
2.lažno pozitivno Traka PCR pojačanja koja se pojavljuje u skladu je s trakom ciljne sekvence, a ponekad je traka urednija i svjetlija.Neodgovarajući dizajn primera: Odabrana sekvenca za pojačanje ima homologiju s sekvencom koja nije ciljna za amplificiranje, tako da je pri izvođenju PCR amplifikacije produkt amplificirane PCR neciljna sekvenca.Ako je ciljna sekvenca prekratka ili je početnica prekratka, lako može doći do lažno pozitivnih rezultata.Primere je potrebno redizajnirati.Unakrsna kontaminacija ciljnih sekvenci ili proizvoda pojačanja: Dva su razloga za ovu kontaminaciju: Prvo, unakrsna kontaminacija cijelog genoma ili velikih fragmenata, što dovodi do lažno pozitivnih rezultata.Ovaj lažno pozitivan može se riješiti sljedećim metodama: Budite pažljivi i nježni dok radite kako biste spriječili da ciljna sekvenca bude usisana u pištolj za uzorke ili da ispadne iz epruvete centrifuge.Osim enzima i tvari koje ne podnose visoke temperature, sve reagense ili opremu treba sterilizirati visokim tlakom.Sve centrifugalne epruvete i vrhove pipeta za ubrizgavanje uzorka treba upotrijebiti jednom.Ako je potrebno, reakcijske epruvete i reagensi ozračuju se ultraljubičastim svjetlom prije dodavanja uzorka kako bi se uništile prisutne nukleinske kiseline.Drugi je kontaminacija malih fragmenata nukleinskih kiselina u zraku.Ovi mali fragmenti su kraći od ciljne sekvence, ali imaju određenu homologiju.Mogu se spajati jedan s drugim, a nakon što budu komplementarni s početnicama, PCR produkti se mogu pojačati, što rezultira lažno pozitivnim rezultatima, koji se mogu smanjiti ili eliminirati ugniježđenim PCR metodama.
3. Pojavljuju se trake nespecifičnog pojačanja Trake koje se pojavljuju nakon PCR amplifikacije nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo veće ili manje, ili se istovremeno pojavljuju trake specifičnog pojačanja i trake nespecifičnog pojačanja.Razlozi za pojavu nespecifičnih vrpci su: prvo, početnice nisu u potpunosti komplementarne s ciljnom sekvencom, ili se početnice agregiraju u dimere.Drugi razlog je previsoka koncentracija Mg2+ iona, preniska temperatura žarenja i previsok broj PCR ciklusa.Drugi faktor je kvaliteta i kvantiteta enzima.Enzimi iz nekih izvora često su skloni nespecifičnim vrpcama, ali enzimi iz drugih izvora nisu.Prekomjerne količine enzima ponekad mogu dovesti do nespecifičnog pojačanja.Protumjere uključuju: redizajn temeljnih premaza ako je potrebno.Smanjite količinu enzima ili ga zamijenite drugim izvorom.Smanjite količinu primera, povećajte količinu predloška na odgovarajući način i smanjite broj ciklusa.Povećajte temperaturu žarenja na odgovarajući način ili upotrijebite metodu dvije temperaturne točke (denaturacija na 93°C, žarenje i produljenje oko 65°C).
4. Pojavljuju se ljuspičasto povlačenje ili mrlje. PCR amplifikacija se ponekad pojavljuje kao razmazane trake, trake poput lista ili trake poput tepiha.Razlozi su često uzrokovani prevelikom količinom enzima ili lošom kvalitetom enzima, previsokom koncentracijom dNTP-a, previsokom koncentracijom Mg2+, preniskom temperaturom žarenja i previše ciklusa.Protumjere uključuju: ① Smanjite količinu enzima ili zamijenite enzim drugim izvorom.②Smanjite koncentraciju dNTP.Odgovarajuće smanjiti koncentraciju Mg2+.Povećajte količinu predložaka i smanjite broj ciklusa