PCR FAQ 1. Falešně negativní, neobjeví se žádný amplifikační proužek 2. Falešně pozitivní 3. Objeví se nespecifické amplifikační proužky 4. Objeví se šupinaté tažné proužky nebo roztěrové proužky：

1Falešně negativní, neobjevuje se žádný amplifikovaný pás Klíčovými aspekty reakce PCR jsou

① příprava templátové nukleové kyseliny

② kvalita a specifičnost primeru

③ kvalita enzymů a

④ Podmínky cyklu PCR.Chcete-li najít důvody, měla by být provedena analýza a výzkum na výše uvedených odkazech.

Šablona:

① Šablona obsahuje proteiny nečistot

② Šablona obsahuje inhibitory enzymu Taq

③ Proteiny v templátu nejsou štěpeny a odstraněny, zejména histony v chromozomech

④ Během extrakce a přípravy šablony se ztratilo příliš mnoho nebo byl vdechnut fenol

⑤ Templátová nukleová kyselina není zcela denaturována.Když je kvalita enzymů a primerů dobrá a neobjeví se amplifikační pásy, je s největší pravděpodobností něco v nepořádku s procesem štěpení vzorku nebo s procesem extrakce templátové nukleové kyseliny.Proto musí být připraven účinný a stabilní trávicí roztok a postup by měl být pevně stanoven a neměl by být libovolně měněn..Inaktivace enzymů: Je nutné nahradit nový enzym nebo použít staré i nové enzymy současně k analýze, zda falešné negativy nejsou způsobeny ztrátou nebo nedostatečnou aktivitou enzymu.Je třeba poznamenat, že někdy se na enzym Taq zapomíná. Primery: Kvalita primeru, koncentrace primeru a to, zda jsou koncentrace dvou primerů symetrické, jsou běžnými důvody selhání PCR nebo neuspokojivé amplifikační pásy a snadná difúze.U některých šarží jsou problémy s kvalitou syntézy primerů.Jeden ze dvou primerů má vysokou koncentraci a druhý má nízkou koncentraci, což má za následek nízkoúčinnou asymetrickou amplifikaci.

Protiopatření jsou:

① Vyberte dobrou jednotku pro syntézu primeru.

② Koncentrace primerů by neměla sledovat pouze hodnotu OD, ale také věnovat pozornost zásobnímu roztoku primeru pro elektroforézu na agarózovém gelu.Musí existovat primerové pásy a jas dvou primerových pásů by měl být zhruba stejný.Například jeden primer má pruh a druhý primer žádný pruh.U stripů může v tuto chvíli PCR selhat a měla by být vyřešena jednáním s jednotkou pro syntézu primeru.Pokud má jeden primer vysoký jas a druhý nízký jas, vyrovnejte koncentrace při ředění primerů.

③ Primery by měly být skladovány ve vysoké koncentraci a malém množství, aby se zabránilo opakovanému zmrazování a rozmrazování nebo dlouhodobému skladování v chladničce, což může vést ke znehodnocení a degradaci primerů.

④Návrh primeru je nerozumný, např. délka primeru není dostatečná, mezi primery se tvoří dimery atd. Koncentrace Mg2+: Koncentrace iontů Mg2+ má velký vliv na účinnost amplifikace PCR.Pokud je koncentrace příliš vysoká, může snížit specificitu PCR amplifikace.Pokud je koncentrace příliš nízká, ovlivní to výtěžek amplifikace PCR a dokonce způsobí selhání amplifikace PCR bez amplifikačních pásů.Změny reakčního objemu: Obvykle jsou objemy používané pro PCR amplifikaci 20 ul, 30 ul a 50 ul.Nebo 100 ul, jaký objem by měl být použit pro PCR amplifikaci, je nastaven podle různých účelů vědeckého výzkumu a klinického testování.Po vyrobení malého objemu, např. 20ul, a následném vytvoření většího objemu, musíte dodržet podmínky, jinak snadno selže.Fyzikální důvody: Denaturace je pro PCR amplifikaci velmi důležitá.Pokud je teplota denaturace nízká a doba denaturace krátká, velmi pravděpodobně dojde k falešným negativům;teplota žíhání je příliš nízká, což může způsobit nespecifickou amplifikaci a snížit specifickou účinnost amplifikace.Teplota žíhání je příliš vysoká.Vysoce ovlivňuje vazbu primerů na templáty a snižuje účinnost amplifikace PCR.Někdy je nutné použít běžný teploměr ke kontrole teplot denaturace, žíhání a extenze v zesilovači nebo ve vodě rozpustném hrnci.To je také jeden z důvodů selhání PCR.Variace cílové sekvence: Pokud je cílová sekvence mutována nebo deletována, což ovlivňuje specifickou vazbu primeru k templátu, nebo primer a templát ztratí komplementární sekvenci v důsledku delece určitého segmentu cílové sekvence, PCR amplifikace nebude úspěšná.

2. falešně pozitivní Pás amplifikace PCR, který se objeví, je konzistentní s pásem cílové sekvence a někdy je pás uspořádanější a jasnější.Nevhodný návrh primeru: Vybraná amplifikační sekvence má homologii s necílovou amplifikační sekvencí, takže při provádění PCR amplifikace je amplifikovaný produkt PCR necílová sekvence.Pokud je cílová sekvence příliš krátká nebo primer příliš krátký, může snadno dojít k falešným pozitivům.Primery je třeba předělat.Křížová kontaminace cílových sekvencí nebo amplifikačních produktů: Pro tuto kontaminaci existují dva důvody: Za prvé, křížová kontaminace celého genomu nebo velkých fragmentů, která vede k falešným pozitivům.Tento falešně pozitivní výsledek lze vyřešit následujícími metodami: Při práci buďte opatrní a opatrní, abyste zabránili nasátí cílové sekvence do vzorkovací pistole nebo vystříknutí z centrifugační zkumavky.Kromě enzymů a látek, které nesnesou vysoké teploty, by měla být všechna činidla nebo zařízení sterilizována vysokým tlakem.Všechny centrifugační zkumavky a špičky pipet pro vstřikování vzorku by měly být použity jednou.V případě potřeby se reakční zkumavky a činidla před přidáním vzorku ozáří ultrafialovým světlem, aby se zničily přítomné nukleové kyseliny.Druhým je kontaminace malých fragmentů nukleových kyselin ve vzduchu.Tyto malé fragmenty jsou kratší než cílová sekvence, ale mají určitou homologii.Mohou být vzájemně spojeny a poté, co byly komplementární k primerům, mohou být produkty PCR amplifikovány, což vede k falešně pozitivním výsledkům, které lze snížit nebo eliminovat metodami nested PCR.

 

3. Objeví se nespecifické amplifikační pruhy Pruhy, které se objeví po PCR amplifikaci, nejsou konzistentní s očekávanou velikostí, buď jsou větší nebo menší, nebo se objevují specifické amplifikační pruhy i nespecifické amplifikační pruhy současně.Důvody pro výskyt nespecifických pásů jsou: za prvé, primery nejsou zcela komplementární k cílové sekvenci nebo primery agregují za vzniku dimerů.Druhým důvodem je příliš vysoká koncentrace iontů Mg2+, příliš nízká teplota žíhání a příliš vysoký počet cyklů PCR.Druhým faktorem je kvalita a množství enzymu.Enzymy z některých zdrojů jsou často náchylné k nespecifickým pásům, ale enzymy z jiných zdrojů nikoli.Nadměrné množství enzymů může někdy vést k nespecifické amplifikaci.Protiopatření zahrnují: v případě potřeby redesign primerů.Snižte množství enzymu nebo jej nahraďte jiným zdrojem.Snižte množství primerů, přiměřeně zvyšte množství templátu a snižte počet cyklů.Přiměřeně zvyšte teplotu žíhání nebo použijte metodu dvou teplotních bodů (denaturace při 93°C, žíhání a extenze kolem 65°C).

 

4. Objevuje se šupinatá drenáž nebo nátěry PCR amplifikace se někdy projevuje jako rozmazané pásy, pásy podobné listům nebo pásy podobné koberci.Příčinou je často příliš mnoho enzymu nebo špatná kvalita enzymu, příliš vysoká koncentrace dNTP, příliš vysoká koncentrace Mg2+, příliš nízká teplota žíhání a příliš mnoho cyklů.Protiopatření zahrnují: ① Snižte množství enzymu nebo nahraďte enzym jiným zdrojem.②Snižte koncentraci dNTP.Vhodně snižte koncentraci Mg2+.Zvyšte množství šablon a snižte počet cyklů