Oftaj Demandoj pri PCR 1. Falsa negativo, neniu plifortiga bando aperas 2. Falsa pozitiva 3. Nespecifaj plifortigaj bandoj aperas 4. Aperas flokaj trenaj strioj aŭ ŝmirstrioj:

1 Falsa negativa, neniu amplifita bando aperas La ŝlosilaj aspektoj de la PCR-reago estas

① preparado de ŝablono nuklea acido

② primer kvalito kaj specifeco

③ enzimo kvalito kaj

④ PCR-ciklokondiĉoj.Por trovi la kialojn, analizo kaj esplorado ankaŭ devus esti faritaj sur la supraj ligiloj.

Ŝablono:

① La ŝablono enhavas malpurajn proteinojn

② La ŝablono enhavas Taq-enziminhibintojn

③ La proteinoj en la ŝablono ne estas digestitaj kaj forigitaj, precipe la histonoj en kromosomoj

④ Tro multe perdiĝis dum la eltiro kaj preparado de la ŝablono, aŭ fenolo estis enspirita

⑤La ŝablona nuklea acido ne estas tute denaturita.Kiam la kvalito de enzimoj kaj enkondukoj estas bona, se plifortigaj bandoj ne aperas, plej verŝajne estas io misa kun la digesta procezo de la specimeno aŭ la ŝablono nukleacida ekstrakta procezo.Tial efika kaj stabila digesta solvo devas esti preparita, kaj la proceduro devas esti fiksita kaj ne ŝanĝita laŭvole..Enzima malaktivigo: Necesas anstataŭigi la novan enzimon, aŭ uzi ambaŭ malnovajn kaj novajn enzimojn samtempe por analizi ĉu falsaj negativoj estas kaŭzitaj de perdo aŭ nesufiĉa enzima aktiveco.Oni devas rimarki, ke foje la Taq-enzimo estas forgesita.Primers: Primerkvalito, primerkoncentriĝo, kaj ĉu la koncentriĝoj de la du enkondukoj estas simetriaj estas oftaj kialoj de PCR-malsukceso aŭ nekontentigaj plifortigaj grupoj kaj facila disvastigo.Estas problemoj kun la kvalito de primer-sintezo en kelkaj aroj.Unu el la du enkondukoj havas altan koncentriĝon kaj la alia havas malaltan koncentriĝon, rezultigante malalt-efikecan malsimetrian plifortigon.

La kontraŭrimedoj estas:

① Elektu bonan enkondukan sintezan unuon.

② La koncentriĝo de enkondukoj ne nur rigardu la OD-valoron, sed ankaŭ atentu la primeran stoksolvon por agarose-ĝela elektroforezo.Devas ekzisti enkondukaj bendoj, kaj la brileco de la du enkondukaj bandoj devus esti proksimume la sama.Ekzemple, unu enkonduko havas bendon kaj la alia enkonduko havas neniun bandon.Por strioj, PCR povas malsukcesi ĉe tiu tempo kaj devus esti solvita tra intertraktado kun la enkonduka sintezunuo.Se unu enkonduko havas altan brilon kaj la alia havas malaltan brilon, balancu la koncentriĝojn dum diluado de la enkondukoj.

③ Primeroj devas esti stokitaj en alta koncentriĝo kaj malgrandaj kvantoj por malhelpi ripetan frostiĝon kaj degelon aŭ longdaŭran konservadon en la fridujo, kio povas konduki al difekto kaj degenero de la enkondukoj.

④La enkonduka dezajno estas malracia, kiel la enkonduka longo ne sufiĉas, dimeroj estas formitaj inter enkondukoj, ktp. Mg2+-koncentriĝo: Mg2+-jonkoncentriĝo havas grandan influon sur PCR-amplifiko-efikeco.Se la koncentriĝo estas tro alta, ĝi povas redukti la specifecon de PCR-plifortigo.Se la koncentriĝo estas tro malalta, ĝi influos la PCR-amplifigan rendimenton kaj eĉ kaŭzos la PCR-plifortigon malsukcesi sen plifortigado de bandoj.Ŝanĝoj en reakcia volumo: Kutime la volumoj uzataj por PCR-plifortigo estas 20ul, 30ul kaj 50ul.Aŭ 100ul, kia volumo devus esti uzata por PCR-ampligado estas fiksita laŭ malsamaj celoj de scienca esplorado kaj klinika testado.Post fari malgrandan volumon, kiel 20ul, kaj poste fari pli grandan volumon, vi devas sekvi la kondiĉojn, alie ĝi facile malsukcesos.Fizikaj kialoj: Denaturado estas tre grava por PCR-plifortigo.Se la denatura temperaturo estas malalta kaj la denatura tempo estas mallonga, falsaj negativoj tre verŝajne okazas;la kalcia temperaturo estas tro malalta, kio povas kaŭzi nespecifan plifortigon kaj redukti la specifan plifortigan efikecon.La kalcia temperaturo estas tro alta.Tre influas la ligadon de enkondukoj al ŝablonoj kaj reduktas PCR-amplifigan efikecon.Kelkfoje necesas uzi norman termometron por kontroli la denaturajn, kalcigajn kaj etendajn temperaturojn en la amplifilo aŭ akvosolvebla poto.Ĉi tio ankaŭ estas unu el la kialoj de PCR-malsukceso.Cel-sekvencovario: Se la celsekvenco estas mutaciita aŭ forigita, kiu influas la specifan ligadon de la enkonduko al la ŝablono, aŭ la enkonduko kaj ŝablono perdas la komplementan sekvencon pro la forigo de certa segmento de la celsekvenco, la PCR-plifortigo. ne sukcesos.

2.falsa pozitiva La PCR-amplifiga bando, kiu aperas, kongruas kun la cel-sekvenca bando, kaj foje la bando estas pli orda kaj pli hela.Malkonvena enkonduka dezajno: La elektita plifortiga sekvenco havas homologion kun la ne-cela plifortiga sekvenco, do dum elfarado de PCR-plifortigo, la plifortigita PCR-produkto estas ne-cela sekvenco.Se la celsekvenco estas tro mallonga aŭ la enkonduko estas tro mallonga, falsaj pozitivoj povas facile okazi.Primeroj devas esti restrukturitaj.Krucpoluado de celsekvencoj aŭ plifortigaj produktoj: Estas du kialoj de ĉi tiu poluado: Unue, krucpoluado de la tuta genaro aŭ grandaj fragmentoj, kondukante al falsaj pozitivoj.Ĉi tiu falsa pozitivo povas esti solvita per la sekvaj metodoj: Estu singarda kaj milda dum funkciado por malhelpi la celsekvencon esti suĉita en la specimenan pafilon aŭ ŝprucigi el la centrifugila tubo.Krom enzimoj kaj substancoj, kiuj ne povas elteni altajn temperaturojn, ĉiuj reakciiloj aŭ ekipaĵoj devas esti steriligitaj per alta premo.Ĉiuj centrifugilaj tuboj kaj specimenaj injektaj pipetpipetoj devas esti uzataj unufoje.Se necese, la reakcituboj kaj reakciiloj estas surradiitaj per transviola lumo antaŭ ol aldoni la specimenon por detrui la ĉeestantajn nukleajn acidojn.La dua estas la poluado de malgrandaj fragmentoj de nukleaj acidoj en la aero.Tiuj malgrandaj fragmentoj estas pli mallongaj ol la celsekvenco, sed havas certan homologion.Ili povas esti splisitaj unu al la alia, kaj post esti komplementaj al la enkondukoj, la PCR-produktoj povas esti plifortigitaj, rezultigante falsajn pozitivojn, kiuj povas esti reduktitaj aŭ eliminitaj per nestitaj PCR-metodoj.

 

3.Nespecifaj plifortigaj bandoj aperas La bandoj, kiuj aperas post PCR-amplificado, malkongruas kun la atendata grandeco, ĉu pli granda aŭ pli malgranda, aŭ ambaŭ specifaj amplifaj bandoj kaj nespecifaj amplifigaj bandoj aperas samtempe.La kialoj de la apero de nespecifaj grupoj estas: unue, la enkondukoj ne estas tute komplementaj al la celsekvenco, aŭ la enkondukoj agregas por formi dimerojn.La dua kialo estas ke la Mg2+-jonkoncentriĝo estas tro alta, la kalcia temperaturo estas tro malalta, kaj la nombro da PCR-cikloj estas tro alta.La dua faktoro estas la kvalito kaj kvanto de la enzimo.Enzimoj de kelkaj fontoj ofte estas emaj al nespecifaj grupoj sed enzimoj de aliaj fontoj ne faras.Troaj kvantoj de enzimoj foje povas konduki al nespecifa plifortigo.La kontraŭrimedoj inkluzivas: restrukturi enkondukojn se necese.Reduktu la kvanton de enzimo aŭ anstataŭigu ĝin per alia fonto.Reduktu la kvanton da enkondukoj, pliigu la kvanton de ŝablono taŭge kaj reduktu la nombron da cikloj.Pliigu taŭge la kalsonan temperaturon aŭ uzu la du-temperaturan punktometodon (malnaturado je 93°C, kalcigado kaj plilongigo ĉirkaŭ 65°C).

 

4.Flaky trenado aŭ ŝmiraĵoj aperas PCR-amplifilo foje aperas kiel ŝmiritaj bandoj, folio-similaj bandoj aŭ tapiŝo-similaj bandoj.La kialoj ofte estas kaŭzitaj de tro da enzimo aŭ malbona kvalito de enzimo, tro alta dNTP-koncentriĝo, tro alta Mg2+-koncentriĝo, tro malalta kalcia temperaturo, kaj tro multaj cikloj.La kontraŭrimedoj inkluzivas: ① Redukti la kvanton de enzimo, aŭ anstataŭigi la enzimon per alia fonto.② Redukti la koncentriĝon de dNTP.Taŭge reduktu la koncentriĝon de Mg2+.Pliigu la kvanton da ŝablonoj kaj redukti la nombron da cikloj