PCR KKK 1. Valenegatiivne, amplifikatsiooniriba ei kuvata 2. Valepositiivne 3. Ilmuvad mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad 4. Ilmuvad helbed lohistamisribad või määrdribad:
1 Valenegatiivne, amplifitseeritud riba ei ilmu PCR reaktsiooni põhiaspektid on
① matriitsi nukleiinhappe valmistamine
② praimeri kvaliteet ja spetsiifilisus
③ ensüümi kvaliteet ja
④ PCR tsükli tingimused.Põhjuste leidmiseks tuleks eelpool toodud linkidelt ka analüüsid ja uuringud läbi viia.
Mall:
① Mall sisaldab lisandvalke
② Mall sisaldab Taq ensüümi inhibiitoreid
③ Mallis olevaid valke ei seedita ega eemaldata, eriti kromosoomide histoone
④ Šablooni ekstraheerimise ja ettevalmistamise ajal läks liiga palju kaduma või hingati fenooli sisse
⑤Matriitsnukleiinhape ei ole täielikult denatureeritud.Kui ensüümide ja praimerite kvaliteet on hea ja kui amplifikatsiooniribasid ei teki, on kõige tõenäolisem, et proovi seedimisprotsessis või matriitsi nukleiinhappe ekstraheerimise protsessis on midagi valesti.Seetõttu tuleb valmistada tõhus ja stabiilne seedimislahus ning protseduur tuleb fikseerida ja seda ei tohiks oma äranägemise järgi muuta..Ensüümi inaktiveerimine: On vaja asendada uus ensüüm või kasutada korraga nii vanu kui ka uusi ensüüme, et analüüsida, kas valenegatiivsed tulemused on põhjustatud ensüümi kadumisest või ebapiisavast aktiivsusest.Tuleb märkida, et mõnikord unustatakse Taq ensüüm. Praimerid: praimeri kvaliteet, praimeri kontsentratsioon ja see, kas kahe praimeri kontsentratsioonid on sümmeetrilised, on PCR ebaõnnestumise või ebarahuldavate amplifikatsiooniribade ja hõlpsa difusiooni tavalised põhjused.Mõne partii puhul on probleeme praimerite sünteesi kvaliteediga.Ühel kahest praimerist on kõrge kontsentratsioon ja teisel madala kontsentratsiooniga, mille tulemuseks on madala efektiivsusega asümmeetriline amplifikatsioon.
Vastumeetmed on järgmised:
① Valige hea praimeri sünteesiüksus.
② Praimerite kontsentratsioon ei peaks arvestama mitte ainult OD väärtust, vaid pöörama tähelepanu ka agaroosgeeli elektroforeesi praimeri põhilahusele.Peavad olema krundiribad ja kahe krundiriba heledus peaks olema ligikaudu sama.Näiteks ühel kruntvärvil on riba ja teisel pole riba.Ribade puhul võib PCR praegu ebaõnnestuda ja see tuleks lahendada praimerite sünteesiüksusega läbirääkimiste teel.Kui üks praimer on suure heledusega ja teine madala heledusega, tasakaalustage praimerite lahjendamisel kontsentratsioone.
③ Praimereid tuleb hoida suures kontsentratsioonis ja väikestes kogustes, et vältida korduvat külmumist ja sulatamist või pikaajalist külmkapis säilitamist, mis võib põhjustada praimerite riknemist ja lagunemist.
④Praimeri disain on ebamõistlik, nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele moodustuvad dimeerid jne. Mg2+ kontsentratsioon: Mg2+ ioonide kontsentratsioonil on suur mõju PCR amplifikatsiooni efektiivsusele.Kui kontsentratsioon on liiga kõrge, võib see vähendada PCR amplifikatsiooni spetsiifilisust.Kui kontsentratsioon on liiga madal, mõjutab see PCR amplifikatsiooni saagist ja isegi põhjustab PCR amplifikatsiooni ebaõnnestumise ilma amplifitseerivate ribadeta.Reaktsiooni mahu muutused: Tavaliselt kasutatakse PCR amplifikatsiooniks 20 ul, 30 ul ja 50 ul.Või 100 ul, milline maht tuleks PCR amplifikatsiooniks kasutada, määratakse vastavalt teadusliku uurimistöö ja kliinilise testimise erinevatele eesmärkidele.Pärast väikese mahu, näiteks 20 ul, ja seejärel suurema mahu valmistamist peate järgima tingimusi, vastasel juhul ebaõnnestub see kergesti.Füüsilised põhjused: denatureerimine on PCR amplifikatsiooni jaoks väga oluline.Kui denatureerimistemperatuur on madal ja denatureerimisaeg lühike, on väga tõenäoline valenegatiivsete tulemus;lõõmutamistemperatuur on liiga madal, mis võib põhjustada mittespetsiifilist võimendust ja vähendada spetsiifilise võimenduse efektiivsust.Lõõmutustemperatuur on liiga kõrge.Mõjutab tugevalt praimerite seondumist matriitsiga ja vähendab PCR amplifikatsiooni efektiivsust.Mõnikord on vaja kasutada tavalist termomeetrit, et kontrollida denaturatsiooni, lõõmutamise ja pikendamise temperatuure võimendis või vees lahustuvas potis.See on ka üks PCR ebaõnnestumise põhjusi.Sihtjärjestuse variatsioon: kui sihtjärjestus on muteerunud või kustutatud, mis mõjutab praimeri spetsiifilist seondumist matriitsiga, või praimer ja matriits kaotavad komplementaarse järjestuse sihtjärjestuse teatud segmendi deletsiooni tõttu, toimub PCR amplifikatsioon. ei õnnestu.
2.valepositiivne Ilmuv PCR amplifikatsiooniriba on kooskõlas sihtjärjestuse ribaga ning mõnikord on riba korrapärasem ja heledam.Sobimatu praimeri disain: valitud amplifikatsioonijärjestus on homoloogias mittesihtmärgiga amplifikatsioonijärjestusega, nii et PCR amplifikatsiooni läbiviimisel on amplifitseeritud PCR produkt mittesihtjärjestus.Kui sihtjärjestus on liiga lühike või praimer liiga lühike, võivad valepositiivsed tulemused kergesti tekkida.Praimerid tuleb ümber kujundada.Sihtjärjestuste või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine: sellel saastumisel on kaks põhjust: esiteks kogu genoomi või suurte fragmentide ristsaastumine, mis toob kaasa valepositiivsed tulemused.Selle valepositiivse tulemuse saab lahendada järgmiste meetoditega: Olge töötamisel ettevaatlik ja õrn, et vältida sihtjärjestuse imemist proovipüstolisse või tsentrifuugitorust välja pritsimist.Kõik reaktiivid või seadmed, välja arvatud ensüümid ja ained, mis ei talu kõrget temperatuuri, tuleb steriliseerida kõrge rõhu all.Kõiki tsentrifuugitorusid ja proovi süstimise pipetiotsikuid tuleks kasutada üks kord.Vajadusel kiiritatakse reaktsioonitorusid ja reaktiive ultraviolettvalgusega enne proovi lisamist, et hävitada esinevad nukleiinhapped.Teine on nukleiinhapete väikeste fragmentide saastumine õhus.Need väikesed fragmendid on sihtjärjestusest lühemad, kuid neil on teatav homoloogia.Neid saab üksteisega splaissida ja pärast praimerite komplementaarsust saab PCR-produkte amplifitseerida, mille tulemuseks on valepositiivsed tulemused, mida saab vähendada või kõrvaldada pesastatud PCR-meetoditega.
3. Ilmuvad mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad Pärast PCR amplifikatsiooni ilmuvad ribad ei ole kooskõlas eeldatava suurusega, kas suuremad või väiksemad, või ilmuvad korraga nii spetsiifilised amplifikatsiooniribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.Mittespetsiifiliste ribade ilmnemise põhjused on järgmised: esiteks ei ole praimerid sihtjärjestusega täielikult komplementaarsed või praimerid agregeeruvad, moodustades dimeere.Teine põhjus on see, et Mg2+ ioonide kontsentratsioon on liiga kõrge, anniilimistemperatuur liiga madal ja PCR tsüklite arv liiga kõrge.Teine tegur on ensüümi kvaliteet ja kogus.Mõnest allikast pärinevad ensüümid on sageli altid mittespetsiifiliste ribade tekkele, kuid teistest allikatest pärit ensüümid mitte.Ensüümide liigne kogus võib mõnikord põhjustada mittespetsiifilist amplifikatsiooni.Vastumeetmed hõlmavad järgmist: vajadusel kruntvärvide ümberkujundamine.Vähendage ensüümi kogust või asendage see mõne muu allikaga.Vähendage praimerite kogust, suurendage sobivalt malli kogust ja vähendage tsüklite arvu.Tõstke anniilimistemperatuuri sobivalt või kasutage kahe temperatuuripunkti meetodit (denatureerimine 93 °C juures, lõõmutamine ja pikendamine umbes 65 °C juures).
4. Ilmuvad helbed või laigud. PCR amplifikatsioon ilmneb mõnikord määrdunud ribadena, lehekujuliste ribadena või vaibataoliste ribadena.Põhjusteks on sageli liiga palju ensüümi või ensüümi halb kvaliteet, liiga kõrge dNTP kontsentratsioon, liiga kõrge Mg2+ kontsentratsioon, liiga madal anniilimistemperatuur ja liiga palju tsükleid.Vastumeetmed hõlmavad järgmist: ① Vähendage ensüümi kogust või asendage ensüüm mõne muu allikaga.② Vähendage dNTP kontsentratsiooni.Vähendage sobivalt Mg2+ kontsentratsiooni.Suurendage mallide arvu ja vähendage tsüklite arvu