سوالات متداول PCR 1. منفی کاذب، بدون باند تقویت ظاهر می شود 2. مثبت کاذب 3. باندهای تقویت غیر اختصاصی ظاهر می شوند 4. نوارهای درگ پوسته پوسته یا نوارهای اسمیر ظاهر می شوند:

1 منفی کاذب، هیچ باند تقویت شده ظاهر نمی شود. جنبه های کلیدی واکنش PCR عبارتند از

① آماده سازی الگوی اسید نوکلئیک

② کیفیت و ویژگی آغازگر

③ کیفیت آنزیم و

④ شرایط چرخه PCR.برای یافتن دلایل باید تحلیل و تحقیق روی لینک های فوق نیز انجام شود.

قالب:

① الگو حاوی پروتئین های ناخالصی است

② این الگو حاوی مهارکننده های آنزیم Taq است

③ پروتئین های موجود در قالب هضم و حذف نمی شوند، به ویژه هیستون های کروموزوم ها

④ مقدار زیادی در طول استخراج و آماده سازی الگو از بین رفت یا فنل استنشاق شد

⑤اسید نوکلئیک الگو به طور کامل دناتوره نشده است.هنگامی که کیفیت آنزیم ها و پرایمرها خوب است، اگر نوارهای تقویت ظاهر نشدند، به احتمال زیاد مشکلی در روند هضم نمونه یا فرآیند استخراج اسید نوکلئیک الگو وجود دارد.بنابراین، باید یک محلول هضم موثر و پایدار تهیه شود و روش باید ثابت شود و به میل خود تغییر داده نشود..غیرفعال سازی آنزیم: لازم است آنزیم جدید جایگزین شود یا از آنزیم های قدیمی و جدید به طور همزمان استفاده شود تا بررسی شود که آیا منفی کاذب ناشی از از دست دادن یا فعالیت ناکافی آنزیم است.لازم به ذکر است که گاهی اوقات آنزیم Taq فراموش می شود. پرایمرها: کیفیت پرایمر، غلظت پرایمر و متقارن بودن غلظت پرایمرها از دلایل شایع شکست PCR یا عدم رضایت باندهای تقویت و انتشار آسان است.مشکلاتی در کیفیت سنتز پرایمر در برخی از دسته ها وجود دارد.یکی از دو پرایمر دارای غلظت بالا و دیگری دارای غلظت پایین است که در نتیجه تقویت نامتقارن با راندمان پایین ایجاد می شود.

اقدامات متقابل عبارتند از:

① یک واحد سنتز پرایمر خوب انتخاب کنید.

② غلظت پرایمرها نه تنها باید به مقدار OD نگاه کند، بلکه باید به محلول استوک پرایمر برای الکتروفورز ژل آگارز نیز توجه کرد.باید نوارهای پرایمر وجود داشته باشد و روشنایی دو باند پرایمر باید تقریباً یکسان باشد.به عنوان مثال، یک پرایمر نوار دارد و پرایمر دیگر بدون نوار.برای نوارها، PCR ممکن است در این زمان شکست بخورد و باید از طریق مذاکره با واحد سنتز پرایمر حل شود.اگر یک پرایمر روشنایی بالا و دیگری روشنایی کم دارد، هنگام رقیق کردن پرایمرها، غلظت ها را متعادل کنید.

③ پرایمرها باید در غلظت بالا و مقادیر کم ذخیره شوند تا از انجماد و ذوب مکرر یا نگهداری طولانی مدت در یخچال جلوگیری شود که ممکن است منجر به خراب شدن و تخریب پرایمرها شود.

④طراحی پرایمر نامعقول است، مانند طول پرایمر کافی نیست، دایمرها بین پرایمرها تشکیل می شوند و غیره. غلظت Mg2+: غلظت یون Mg2+ تأثیر زیادی بر بازده تقویت PCR دارد.اگر غلظت بیش از حد بالا باشد، می تواند ویژگی تقویت PCR را کاهش دهد.اگر غلظت خیلی کم باشد، بر بازده تقویت PCR تأثیر می گذارد و حتی باعث می شود که تقویت PCR بدون تقویت باندها از کار بیفتد.تغییرات حجم واکنش: معمولاً حجم های مورد استفاده برای تقویت PCR 20ul، 30ul و 50ul است.یا 100ul، چه حجمی باید برای تقویت PCR استفاده شود، با توجه به اهداف مختلف تحقیقات علمی و آزمایش های بالینی تنظیم می شود.بعد از ساخت حجم کم مثلا 20ul و بعد ساخت حجم بیشتر باید شرایط رو رعایت کنید وگرنه به راحتی از کار میفته.دلایل فیزیکی: دناتوراسیون برای تقویت PCR بسیار مهم است.اگر دمای دناتوراسیون پایین و زمان دناتوراسیون کوتاه باشد، احتمال وقوع منفی کاذب بسیار زیاد است.دمای بازپخت بسیار پایین است، که می تواند باعث تقویت غیر اختصاصی و کاهش راندمان تقویت خاص شود.دمای بازپخت خیلی بالاست.به شدت بر اتصال پرایمرها به قالب ها تأثیر می گذارد و راندمان تقویت PCR را کاهش می دهد.گاهی اوقات لازم است از یک دماسنج استاندارد برای بررسی دمای دناتوراسیون، بازپخت و گسترش در تقویت کننده یا گلدان محلول در آب استفاده شود.این نیز یکی از دلایل شکست PCR است.تغییر توالی هدف: اگر توالی هدف جهش یا حذف شود، که بر اتصال خاص پرایمر به الگو تأثیر می گذارد، یا پرایمر و الگو به دلیل حذف یک بخش خاص از توالی هدف، توالی مکمل را از دست بدهند، تقویت PCR موفق نخواهد بود.

2. مثبت کاذب نوار تقویت PCR که ظاهر می شود با باند توالی هدف سازگار است و گاهی اوقات نوار منظم تر و روشن تر است.طراحی پرایمر نامناسب: توالی تقویت انتخاب شده با توالی تقویت غیر هدف همسانی دارد، بنابراین هنگام انجام تقویت PCR، محصول PCR تقویت شده یک توالی غیر هدف است.اگر دنباله هدف خیلی کوتاه باشد یا پرایمر خیلی کوتاه باشد، ممکن است به راحتی مثبت کاذب رخ دهد.پرایمرها باید دوباره طراحی شوند.آلودگی متقابل توالی های هدف یا محصولات تقویتی: دو دلیل برای این آلودگی وجود دارد: اول، آلودگی متقاطع کل ژنوم یا قطعات بزرگ که منجر به مثبت کاذب می شود.این مثبت کاذب را می توان با روش های زیر حل کرد: هنگام کار با دقت و ملایمت از مکیده شدن توالی هدف به تفنگ نمونه یا پاشیده شدن آن به بیرون از لوله سانتریفیوژ جلوگیری کنید.به جز آنزیم ها و موادی که نمی توانند در برابر دمای بالا مقاومت کنند، همه معرف ها یا تجهیزات باید با فشار بالا استریل شوند.تمام لوله های سانتریفیوژ و نوک پیپت تزریق نمونه باید یک بار استفاده شوند.در صورت لزوم، لوله‌های واکنش و معرف‌ها قبل از افزودن نمونه با نور ماوراء بنفش تابش می‌شوند تا اسیدهای نوکلئیک موجود را از بین ببرند.مورد دوم آلودگی قطعات کوچک اسیدهای نوکلئیک در هوا است.این قطعات کوچک کوتاهتر از دنباله هدف هستند، اما همسانی خاصی دارند.آنها را می توان به یکدیگر متصل کرد و پس از تکمیل شدن با پرایمرها، محصولات PCR را می توان تقویت کرد و در نتیجه نتایج مثبت کاذب به دست آمد که می توان با روش های PCR تو در تو کاهش یا حذف کرد.

 

3. باندهای تقویت غیر اختصاصی ظاهر می شوند باندهایی که پس از تقویت PCR ظاهر می شوند با اندازه مورد انتظار، بزرگتر یا کوچکتر، مطابقت ندارند، یا هر دو باند تقویت خاص و باندهای تقویت غیر اختصاصی همزمان ظاهر می شوند.دلایل پیدایش باندهای غیر اختصاصی عبارتند از: اول اینکه پرایمرها کاملا مکمل توالی هدف نیستند و یا پرایمرها برای تشکیل دایمرها تجمع می یابند.دلیل دوم این است که غلظت یون Mg2+ خیلی زیاد است، دمای بازپخت خیلی پایین است و تعداد چرخه های PCR خیلی زیاد است.عامل دوم کیفیت و کمیت آنزیم است.آنزیم‌های برخی منابع اغلب مستعد نوارهای غیر اختصاصی هستند، اما آنزیم‌های منابع دیگر اینگونه نیستند.مقادیر بیش از حد آنزیم ها گاهی اوقات می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی شود.اقدامات متقابل عبارتند از: در صورت لزوم طراحی مجدد پرایمرها.مقدار آنزیم را کاهش دهید یا آن را با منبع دیگری جایگزین کنید.مقدار پرایمرها را کاهش دهید، مقدار قالب را به طور مناسب افزایش دهید و تعداد چرخه ها را کاهش دهید.دمای بازپخت را به طور مناسب افزایش دهید یا از روش نقطه دو درجه حرارت (دناتوره شدن در دمای 93 درجه سانتیگراد، بازپخت و گسترش در حدود 65 درجه سانتیگراد) استفاده کنید.

 

4. درگ یا لکه های پوسته پوسته ظاهر می شود. تقویت PCR گاهی به صورت نوارهای لکه دار، نوارهای ورقه مانند یا نوارهای فرش مانند ظاهر می شود.دلایل اغلب ناشی از آنزیم بیش از حد یا کیفیت پایین آنزیم، غلظت بیش از حد dNTP، غلظت بیش از حد Mg2+، دمای بازپخت بسیار پایین و چرخه های زیاد است.اقدامات متقابل عبارتند از: ① کاهش مقدار آنزیم، یا جایگزینی آنزیم با منبع دیگری.②غلظت dNTP را کاهش دهید.غلظت Mg2+ را به طور مناسب کاهش دهید.تعداد قالب ها را افزایش دهید و تعداد چرخه ها را کاهش دهید