Domande frequenti sulla PCR 1. Falso negativo, non appare alcuna banda di amplificazione 2. Falso positivo 3. Appaiono bande di amplificazione non specifiche 4. Appaiono strisce di trascinamento o strisci sfaldati:
1 Falso negativo, non appare alcuna banda amplificata Gli aspetti chiave della reazione PCR sono
① preparazione dell'acido nucleico modello
② qualità e specificità dei primer
③ qualità degli enzimi e
④ Condizioni del ciclo PCR.Per trovare le ragioni, analisi e ricerche dovrebbero essere condotte anche sui collegamenti sopra indicati.
Modello:
① Il modello contiene proteine impure
② Il modello contiene inibitori dell'enzima Taq
③ Le proteine nel modello non vengono digerite e rimosse, soprattutto gli istoni nei cromosomi
④ È stato perso troppo durante l'estrazione e la preparazione del modello oppure è stato inalato il fenolo
⑤L'acido nucleico modello non è completamente denaturato.Quando la qualità degli enzimi e dei primer è buona, se non compaiono bande di amplificazione, è molto probabile che ci sia qualcosa di sbagliato nel processo di digestione del campione o nel processo di estrazione dell'acido nucleico modello.Pertanto, è necessario preparare una soluzione di digestione efficace e stabile e la procedura deve essere fissa e non modificata a piacimento..Inattivazione enzimatica: è necessario sostituire il nuovo enzima o utilizzare contemporaneamente sia gli enzimi vecchi che quelli nuovi per analizzare se i falsi negativi sono causati dalla perdita o dall'attività enzimatica insufficiente.Va notato che a volte l'enzima Taq viene dimenticato.Primer: La qualità dei primer, la concentrazione dei primer e se le concentrazioni dei due primer sono simmetriche sono ragioni comuni per il fallimento della PCR o bande di amplificazione insoddisfacenti e facile diffusione.In alcuni lotti si verificano problemi con la qualità della sintesi dei primer.Uno dei due primer ha un'alta concentrazione e l'altro una bassa concentrazione, con conseguente amplificazione asimmetrica a bassa efficienza.
Le contromisure sono:
① Selezionare una buona unità di sintesi del primer.
② La concentrazione dei primer non dovrebbe considerare solo il valore OD, ma prestare attenzione anche alla soluzione madre di primer per l'elettroforesi su gel di agarosio.Devono esserci delle bande di primer e la luminosità delle due bande di primer dovrebbe essere più o meno la stessa.Ad esempio, un primer ha una banda e l'altro primer non ha banda.Per le strisce, la PCR potrebbe fallire in questo momento e dovrebbe essere risolta attraverso la negoziazione con l'unità di sintesi dei primer.Se un primer ha una luminosità elevata e l'altro una luminosità bassa, bilanciare le concentrazioni durante la diluizione dei primer.
③ I primer devono essere conservati ad alta concentrazione e in piccole quantità per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti o la conservazione a lungo termine nel frigorifero, che potrebbe portare al deterioramento e al degrado dei primer.
④Il design del primer non è ragionevole, ad esempio la lunghezza del primer non è sufficiente, si formano dimeri tra i primer, ecc. Concentrazione di Mg2+: la concentrazione di ioni Mg2+ ha una grande influenza sull'efficienza di amplificazione della PCR.Se la concentrazione è troppo elevata, può ridurre la specificità dell'amplificazione della PCR.Se la concentrazione è troppo bassa, ciò influenzerà la resa dell'amplificazione della PCR e causerà addirittura il fallimento dell'amplificazione della PCR senza amplificare le bande.Variazioni nel volume di reazione: solitamente i volumi utilizzati per l'amplificazione PCR sono 20ul, 30ul e 50ul.Oppure 100ul, il volume da utilizzare per l'amplificazione PCR viene stabilito in base ai diversi scopi della ricerca scientifica e dei test clinici.Dopo aver creato un volume piccolo, ad esempio 20ul, e quindi aver creato un volume maggiore, è necessario seguire le condizioni, altrimenti fallirà facilmente.Motivi fisici: la denaturazione è molto importante per l'amplificazione PCR.Se la temperatura di denaturazione è bassa e il tempo di denaturazione è breve, è molto probabile che si verifichino falsi negativi;la temperatura di ricottura è troppo bassa, il che può causare un'amplificazione non specifica e ridurre l'efficienza di amplificazione specifica.La temperatura di ricottura è troppo alta.Influisce notevolmente sul legame dei primer ai modelli e riduce l'efficienza dell'amplificazione della PCR.A volte è necessario utilizzare un termometro standard per controllare le temperature di denaturazione, ricottura ed estensione nell'amplificatore o nel recipiente idrosolubile.Questo è anche uno dei motivi del fallimento della PCR.Variazione della sequenza target: se la sequenza target è mutata o cancellata, il che influisce sul legame specifico del primer al modello, o se il primer e il modello perdono la sequenza complementare a causa della cancellazione di un determinato segmento della sequenza target, l'amplificazione della PCR non avrà successo.
2.falso positivo La banda di amplificazione della PCR che appare è coerente con la banda della sequenza target e talvolta la banda è più ordinata e più luminosa.Disegno del primer inappropriato: la sequenza di amplificazione selezionata presenta omologia con la sequenza di amplificazione non target, quindi quando si esegue l'amplificazione PCR, il prodotto PCR amplificato è una sequenza non target.Se la sequenza target è troppo corta o il primer è troppo corto, possono facilmente verificarsi falsi positivi.I primer devono essere ridisegnati.Contaminazione incrociata di sequenze target o prodotti di amplificazione: ci sono due ragioni per questa contaminazione: in primo luogo, la contaminazione incrociata dell'intero genoma o di frammenti di grandi dimensioni, che porta a falsi positivi.Questo falso positivo può essere risolto con i seguenti metodi: Prestare attenzione e delicatezza durante l'operazione per evitare che la sequenza target venga risucchiata nella pistola campione o schizzata fuori dalla provetta da centrifuga.Ad eccezione degli enzimi e delle sostanze che non resistono alle alte temperature, tutti i reagenti o le apparecchiature devono essere sterilizzati ad alta pressione.Tutte le provette da centrifuga e i puntali delle pipette per l'iniezione del campione devono essere utilizzati una volta.Se necessario, le provette di reazione e i reagenti vengono irradiati con luce ultravioletta prima di aggiungere il campione per distruggere gli acidi nucleici presenti.Il secondo è la contaminazione di piccoli frammenti di acidi nucleici presenti nell'aria.Questi piccoli frammenti sono più corti della sequenza bersaglio, ma hanno una certa omologia.Possono essere uniti tra loro e, dopo essere stati complementari ai primer, i prodotti della PCR possono essere amplificati, risultando in falsi positivi, che possono essere ridotti o eliminati mediante metodi PCR annidati.
3. Comparsa di bande di amplificazione non specifiche Le bande che appaiono dopo l'amplificazione PCR non sono coerenti con le dimensioni previste, sono più grandi o più piccole, oppure appaiono contemporaneamente sia le bande di amplificazione specifiche che le bande di amplificazione non specifiche.Le ragioni per la comparsa di bande non specifiche sono: in primo luogo, i primer non sono completamente complementari alla sequenza target, oppure i primer si aggregano per formare dimeri.Il secondo motivo è che la concentrazione di ioni Mg2+ è troppo elevata, la temperatura di annealing è troppo bassa e il numero di cicli PCR è troppo elevato.Il secondo fattore è la qualità e la quantità dell'enzima.Gli enzimi provenienti da alcune fonti sono spesso soggetti a bande non specifiche, ma gli enzimi provenienti da altre fonti no.Quantità eccessive di enzimi possono talvolta portare ad un'amplificazione non specifica.Le contromisure includono: riprogettare i primer se necessario.Ridurre la quantità di enzima o sostituirlo con un'altra fonte.Ridurre la quantità di primer, aumentare adeguatamente la quantità di templato e ridurre il numero di cicli.Aumentare opportunamente la temperatura di ricottura oppure utilizzare il metodo a due punti di temperatura (denaturazione a 93°C, ricottura ed estensione intorno a 65°C).
4. Comparsa di strisce o sbavature L'amplificazione della PCR a volte appare come bande sbavate, bande simili a fogli o bande simili a tappeti.Le ragioni sono spesso causate da una quantità eccessiva di enzima o da una scarsa qualità dell'enzima, da una concentrazione troppo elevata di dNTP, da una concentrazione troppo elevata di Mg2+, da una temperatura di ricottura troppo bassa e da troppi cicli.Le contromisure includono: ① Ridurre la quantità di enzima o sostituire l'enzima con un'altra fonte.②Ridurre la concentrazione di dNTP.Ridurre opportunamente la concentrazione di Mg2+.Aumentare la quantità di modelli e ridurre il numero di cicli