PCR FAQ 1. Falsa negativa, nulla amplificatio cohortis apparet 2. Falsae affirmativae 3. Vincula amplificationis non specificae apparent 4. Denudat flaky drag vel linamenta apparent.
Falsa negativa, nulla cohortis ampliata apparet aspectus praecipui PCR reactionis sunt
Praeparatio Formulae acido nuclei
prima qualitate et proprietate
enzyme qualitas et
④ pcr cyclum conditiones.Ad rationes, analyses et inquisitiones inveniendas etiam in nexus superius deduci debent.
Formula:
Exemplum continet immunditiam proteins
Exemplum continet Taq enzyme inhibitors
③ servo in Formula non concoquitur et aufertur, praesertim histonae in chromosomate
④ Nimia in extractione et praeparatione Formulae, seu phenol attractus, perierat
Exemplum acidum nuclei non omnino denatur.Cum enzymes et primariorum qualitas bona est, si vincula amplificationis non apparent, verisimile est aliquid mali inesse cum processu digestionis speciminis vel extractionis acidi nucleici templates.Ergo solutio digestionis efficax et stabilis est praeparanda, et ratio fixa debetque mutari ad libitum..Enzyme inactivatio: Necesse est novum enzymum reponere, sive enzymes tam veteres quam novos simul ad resolvere, sive negativae falsae causantur amissione vel actione enzyme insufficiens.Animadvertendum est interdum Taq enzyme oblitum esse.Primers: Qualitas primarius, primarius concentratio, et an concentrationes duorum primariorum symmetriarum communes sunt rationes PCR defectus vel incassum amplificationis vincula et facile diffusio.Problemata sunt cum synthesi primitivae qualitatem in quibusdam batches.Alter primariorum alte retrahitur, alter retrahitur humilis, unde amplificatio asymmetrica efficientia humilis.
countermeasures sunt:
① Primam summam unitatis boni eligite.
② Concentratio primariorum non solum valorem OD spectare debet, sed etiam solutionem primae stirpis pro agaroso gel electronico-phoresi attendere.Vincula prima debent esse, et claritas duarum primarum adumbrare idem debet.Exempli gratia: unus primarius cohortem habet, alter primarius cohortem non habet.Nam ligamenta, PCR hoc tempore deficere potest et per tractatum cum primario synthesi unitatis resolvi debet.Si unus primarius altam habet splendorem et alter humilis splendorem habet, concentrationes primitivis diluendo componito.
Primitores in retrahitur et exiguis quantitatibus condi debent ne in armario refrigerando et tabida vel diuturna repositione iterata, quae primariorum depravationem et degradationem inducat.
④ Primum consilium irrationabile est, ut prima longitudo non satis est, dimersi inter primarios formantur, etc. Mg2+ concentratio: Mg2+io intentio magnam vim habet in PCR amplificationis efficientiam.Si intentio nimis alta est, potest reducere speciem amplificationis PER.Si intentio est preme, afficiet PCR amplificationem cedere, ac etiam facere, quod per amplificationem deficiet sine vinculis amplificandis.Mutationes in volumine reactionis: Solent volumina ad amplificationem PCR adhibita sunt 20ul, 30ul et 50ul.Vel 100ul, quod volumen ad amplificationem pcr amplificationem adhiberi debet secundum diversos fines investigationis scientificae et probatio clinica.Post parvum volumen, ut 20ul, et deinde volumen maius faciens, conditiones sequi debes, alioquin facile deficies.Rationes physicae: Denaturatio magni momenti est ad amplificationem PCR.Si denaturation temperatus est humilis, et tempus breve est denaturation, falsae negativae valde probabile est evenire;temperatura furnum nimis humilis est, quae amplificationem non specialem causare potest et specifica amplificationis efficientia minuere.Furnum temperatus nimis alta est.Magnopere afficit ligamen primariorum ad templates et reduces PCR amplificationis efficientiam.Interdum necesse est ut thermometrum vexillum ad denaturationem, furnum et extensionem temperaturas in amplificatorio vel aqua solubili in olla reprimat.Hoc etiam unum est ex causis per defectum.Scopus seriei variatio: Si scopum sequentia mutatur vel deletum est, quae adstringit specificam ligamen primarii ad template, vel primarium et templates, consequentiam complementariam amittere propter deletionem cuiusdam portionis scopo sequentiarum, amplificationis PCR. non erit felix.
2. Falsus affirmativus PCR amplificationis cohortis, quae apparet, cohaerere cum cohorte sequentiarum scopo, et interdum band ordinatius et splendidius est.Inconvenienter primario designatio: Ordo amplificationis selectae habet sequentiam homologiam cum amplificatione non-target, ergo cum per amplificationem faciendo, PCR ampliatio productum est a non-scopa sequentia.Si sequentia scopo brevior est vel primario brevior est, positivi falsum facile occurrere potest.Primores redesignandi sunt.Crux-contaminatio scopo sequentiarum vel amplificationis productorum: Duae sunt rationes huius contaminationis: Prima, crux-contaminatio totius genome vel magnarum fragmentorum, ducens ad falsas positivas.Falsum hoc affirmativum his modis solvi potest: Cave et lenis in operando ne scopo seriei in sclopetum sugatur vel e tubi centrifugii spargatur.Exceptis enzymis et substantiis quae altae temperaturae sustinere non possunt, omnes regentes vel apparatum altum pressuram esse debent.Omnes fistulae centrifugiae et iniectio pipettae apicibus specimen semel utendum est.Si opus est, fistulae reactiones et reagentia luce ultraviolacea irradiantur antequam speciminis adiciantur ad delenda acida nucleica praesentem.Secunda est contagium fragmentorum parvorum acidarum nucleicorum in aere.Haec parva fragmenta seriei scopo breviora sunt, sed certa homologia.Inter se dividi possunt, et cum primariis complementaria, PCR producta ampliari possunt, ex falsis positivis, quae per nidificationem per methodos reduci vel eliminari possunt.
3. Vincula amplificationis specificae non apparent Vincula quae per amplificationem apparent, repugnant magnitudine expectatae, vel majoris vel minoris, vel ambae vincula amplificationis specificae et vincula amplificationis specificae simul apparent.Rationes speciei vincularum non specialium sunt: primo, primarii non sunt omnino completiva seriei scopo, vel primariorum aggregatio ad formandum dimers.Secunda causa est, quia intentio Mg2+ion nimis alta est, temperatura furnum nimis humilis est, et numerus cyclorum PCR nimis altus est.Secundum est enzyme qualitas et quantitas.Enzymes e quibusdam fontibus saepe prona sunt ad vincula non specialia, sed enzymes aliunde non.Nimia enzymorum copia interdum ad amplificationem non specificam ducere potest.Inclusiones countermeasures: redesign primers si necesse est.Moles enzyme minuere vel ex alio fonte repone.Moles primariorum reducere, moles Formulae congruenter auge, et numerum cyclorum minue.Furnum temperaturas apte auge vel methodo punc- turae temperaturae utere (denaturatio ad 93°C, furnum et extensionem circa 65°C).
4.Flaky drag vel illins apparent pcr amplificationem interdum apparent sicut ligaturae illitae, fasciae schedae similes vel ligaturae sicut tapete.Rationes saepe causantur ex nimia enzyme vel enzyme qualitate, nimis alta dNTP intentione, nimis alta Mg2+ intentione, temperatura furnum nimis humilis, et etiam plures cycli.Mensurae includunt: ① Enzyme moles reducere vel enzyme cum alio fonte reponere.reducere intentionem dNTP.Apte reducere Mg2+ intentionem.Formulae auge et numerum cyclorum minuere