PCR FAQ 1. Viltus negatīvs, neparādās amplifikācijas josla 2. Viltus pozitīva 3. Parādās nespecifiskas amplifikācijas joslas 4. Parādās pārslainas vilkšanas sloksnes vai uztriepes joslas:

1 Viltus negatīvs, neparādās pastiprināta josla Galvenie PCR reakcijas aspekti ir

① nukleīnskābes šablona sagatavošana

② grunts kvalitāte un specifika

③ fermentu kvalitāti un

④ PCR cikla apstākļi.Lai noskaidrotu iemeslus, analīze un izpēte jāveic arī iepriekš minētajās saitēs.

Veidne:

① Veidne satur piemaisījumu proteīnus

② Veidne satur Taq enzīmu inhibitorus

③ Veidnē esošie proteīni netiek sagremoti un izņemti, īpaši histoni hromosomās

④ Veidnes ekstrakcijas un sagatavošanas laikā tika zaudēts pārāk daudz, vai arī tika ieelpots fenols

⑤ Šablona nukleīnskābe nav pilnībā denaturēta.Ja fermentu un praimeru kvalitāte ir laba, ja neparādās amplifikācijas joslas, visticamāk, ka parauga gremošanas procesā vai šablona nukleīnskābes ekstrakcijas procesā kaut kas nav kārtībā.Tāpēc ir jāsagatavo efektīvs un stabils gremošanas šķīdums, kā arī procedūra ir jāfiksē un to nedrīkst mainīt pēc vēlēšanās..Fermentu inaktivācija: ir nepieciešams aizstāt jauno enzīmu vai vienlaikus izmantot gan vecos, gan jaunos enzīmus, lai analizētu, vai kļūdaini negatīvi nav radušies enzīma zuduma vai nepietiekamas aktivitātes dēļ.Jāņem vērā, ka dažkārt tiek aizmirsts par Taq enzīmu. Praimeri: praimeru kvalitāte, praimeru koncentrācija un tas, vai abu praimeru koncentrācijas ir simetriskas, ir bieži sastopami PCR neveiksmes vai neapmierinošu amplifikācijas joslu un vieglas difūzijas iemesli.Dažās partijās ir problēmas ar primeru sintēzes kvalitāti.Vienam no diviem praimeriem ir augsta koncentrācija, bet otram ir zema koncentrācija, kā rezultātā tiek iegūta zemas efektivitātes asimetriskā pastiprināšana.

Pretpasākumi ir:

① Izvēlieties labu grunts sintēzes vienību.

② Praimeru koncentrācijai ir jāņem vērā ne tikai OD vērtība, bet arī jāpievērš uzmanība agarozes gēla elektroforēzes praimeru pamatšķīdumam.Jābūt gruntēšanas joslām, un abu gruntēšanas joslu spilgtumam jābūt aptuveni vienādam.Piemēram, vienam gruntējumam ir josla, bet otram gruntējumam nav joslas.Sloksnēm PCR pašlaik var neizdoties, un tas ir jāatrisina sarunās ar primer sintēzes vienību.Ja vienam gruntim ir augsts spilgtums, bet otram ir zems spilgtums, atšķaidot gruntskrāsas, sabalansējiet koncentrācijas.

③ Gruntskrāsas jāuzglabā lielā koncentrācijā un nelielos daudzumos, lai novērstu atkārtotu sasalšanu un atkausēšanu vai ilgstošu uzglabāšanu ledusskapī, kas var izraisīt gruntskrāsu nolietošanos un noārdīšanos.

④Primera dizains ir nepamatots, piemēram, primera garums nav pietiekams, starp primeriem veidojas dimēri utt. Mg2+ koncentrācija: Mg2+ jonu koncentrācijai ir liela ietekme uz PCR amplifikācijas efektivitāti.Ja koncentrācija ir pārāk augsta, tas var samazināt PCR amplifikācijas specifiku.Ja koncentrācija ir pārāk zema, tas ietekmēs PCR amplifikācijas iznākumu un pat izraisīs PCR amplifikācijas neveiksmi bez pastiprināšanas joslām.Izmaiņas reakcijas tilpumā: parasti PCR pastiprināšanai izmantotie tilpumi ir 20ul, 30ul un 50ul.Vai 100ul, kāds tilpums jāizmanto PCR pastiprināšanai, tiek noteikts atbilstoši dažādiem zinātniskās izpētes un klīniskās pārbaudes mērķiem.Pēc neliela apjoma, piemēram, 20ul, un pēc tam lielāka tilpuma izgatavošanas jums jāievēro nosacījumi, pretējā gadījumā tas viegli neizdosies.Fiziski iemesli: denaturācija ir ļoti svarīga PCR pastiprināšanai.Ja denaturācijas temperatūra ir zema un denaturācijas laiks ir īss, ļoti iespējams, ka radīsies kļūdaini negatīvi rezultāti;atkausēšanas temperatūra ir pārāk zema, kas var izraisīt nespecifisku pastiprinājumu un samazināt specifiskās pastiprināšanas efektivitāti.Atkausēšanas temperatūra ir pārāk augsta.Ļoti ietekmē primeru saistīšanos ar veidnēm un samazina PCR amplifikācijas efektivitāti.Dažreiz ir nepieciešams izmantot standarta termometru, lai pārbaudītu denaturācijas, atkvēlināšanas un pagarināšanas temperatūru pastiprinātājā vai ūdenī šķīstošā katlā.Tas ir arī viens no PCR neveiksmes iemesliem.Mērķa sekvences variācija: ja mērķa secība ir mutēta vai dzēsta, kas ietekmē primera specifisko saistīšanos ar veidni, vai arī praimeris un veidne zaudē komplementāro secību noteikta mērķa sekvences segmenta dzēšanas dēļ, PCR amplifikācija. nebūs veiksmīga.

2. viltus pozitīvs Parādītā PCR amplifikācijas josla atbilst mērķa secības joslai, un dažreiz josla ir sakārtotāka un gaišāka.Nepiemērots praimera dizains: atlasītajai amplifikācijas secībai ir homoloģija ar nemērķa amplifikācijas secību, tāpēc, veicot PCR amplifikāciju, pastiprinātais PCR produkts ir nemērķa secība.Ja mērķa secība ir pārāk īsa vai primer ir pārāk īss, var viegli rasties kļūdaini pozitīvi rezultāti.Grunts ir jāpārveido.Mērķa sekvenču vai amplifikācijas produktu savstarpēja piesārņošana: šim piesārņojumam ir divi iemesli: pirmkārt, visa genoma vai lielu fragmentu savstarpēja inficēšanās, kas izraisa viltus pozitīvus rezultātus.Šo viltus pozitīvo rezultātu var atrisināt, izmantojot šādas metodes: Darbojoties, esiet piesardzīgs un saudzīgs, lai novērstu mērķa secības iesūkšanos parauga pistolē vai izšļakstīšanos no centrifūgas mēģenes.Izņemot fermentus un vielas, kas neiztur augstu temperatūru, visi reaģenti vai aprīkojums ir jāsterilizē ar augstu spiedienu.Visas centrifūgas mēģenes un parauga injekcijas pipetes uzgaļi ir jāizmanto vienreiz.Ja nepieciešams, pirms parauga pievienošanas reakcijas mēģenes un reaģentus apstaro ar ultravioleto gaismu, lai iznīcinātu esošās nukleīnskābes.Otrais ir nelielu nukleīnskābju fragmentu piesārņojums gaisā.Šie mazie fragmenti ir īsāki par mērķa secību, taču tiem ir noteikta homoloģija.Tos var savienot viens ar otru, un pēc tam, kad tie ir komplementāri ar primeriem, PCR produkti var tikt pastiprināti, radot viltus pozitīvus rezultātus, kurus var samazināt vai novērst ar ligzdotas PCR metodēm.

 

3. Parādās nespecifiskas amplifikācijas joslas Joslas, kas parādās pēc PCR amplifikācijas, neatbilst paredzamajam izmēram, lielākas vai mazākas, vai arī vienlaikus parādās gan specifiskās amplifikācijas joslas, gan nespecifiskās amplifikācijas joslas.Nespecifisku joslu parādīšanās iemesli ir šādi: pirmkārt, praimeri nav pilnībā komplementāri mērķa secībai, vai arī primeri agregējas, veidojot dimērus.Otrs iemesls ir tas, ka Mg2+ jonu koncentrācija ir pārāk augsta, atkvēlināšanas temperatūra ir pārāk zema un PCR ciklu skaits ir pārāk augsts.Otrais faktors ir fermenta kvalitāte un daudzums.Fermenti no dažiem avotiem bieži ir pakļauti nespecifiskām joslām, bet enzīmi no citiem avotiem to nedara.Pārmērīgs enzīmu daudzums dažkārt var izraisīt nespecifisku pastiprināšanos.Pretpasākumi ietver: ja nepieciešams, pārveidojiet gruntskrāsas.Samaziniet fermenta daudzumu vai nomainiet to ar citu avotu.Samaziniet primeru daudzumu, atbilstoši palieliniet veidnes daudzumu un samaziniet ciklu skaitu.Atbilstoši paaugstiniet atkausēšanas temperatūru vai izmantojiet divu temperatūru punktu metodi (denaturēšana 93°C, atkausēšana un pagarināšana aptuveni 65°C).

 

4. Parādās plēkšņaina vilkšana vai traipi. PCR pastiprinājums dažkārt parādās kā izsmērētas joslas, loksnēm līdzīgas joslas vai paklājam līdzīgas joslas.Iemeslus bieži izraisa pārāk daudz fermentu vai slikta fermenta kvalitāte, pārāk augsta dNTP koncentrācija, pārāk augsta Mg2+ koncentrācija, pārāk zema atkausēšanas temperatūra un pārāk daudz ciklu.Pretpasākumi ietver: ① Samaziniet fermenta daudzumu vai nomainiet fermentu ar citu avotu.② Samaziniet dNTP koncentrāciju.Attiecīgi samaziniet Mg2+ koncentrāciju.Palieliniet veidņu skaitu un samaziniet ciklu skaitu