Veelgestelde vragen over PCR 1. Vals-negatief, er verschijnt geen amplificatieband 2. Vals-positief 3. Niet-specifieke amplificatiebanden verschijnen 4. Er verschijnen schilferige sleepstrips of smeerstrips:
1Vals negatief, er verschijnt geen geamplificeerde band. De belangrijkste aspecten van de PCR-reactie zijn
① bereiding van matrijsnucleïnezuur
② primerkwaliteit en specificiteit
③ enzymkwaliteit en
④ PCR-cyclusomstandigheden.Om de redenen te vinden, moeten analyses en onderzoek ook op de bovenstaande links worden uitgevoerd.
Sjabloon:
① De template bevat onzuiverheidseiwitten
② De template bevat Taq-enzymremmers
③ De eiwitten in de sjabloon worden niet verteerd en verwijderd, vooral de histonen in chromosomen
④ Er ging te veel verloren tijdens de extractie en voorbereiding van de sjabloon, of er werd fenol ingeademd
⑤Het templatenucleïnezuur is niet volledig gedenatureerd.Wanneer de kwaliteit van enzymen en primers goed is en er geen amplificatiebanden verschijnen, is het zeer waarschijnlijk dat er iets mis is met het verteringsproces van het monster of het extractieproces van template-nucleïnezuren.Daarom moet er een effectieve en stabiele verteringsoplossing worden bereid, en de procedure moet worden vastgesteld en mag niet naar believen worden gewijzigd..Enzym-inactivatie: Het is noodzakelijk om het nieuwe enzym te vervangen, of zowel oude als nieuwe enzymen tegelijkertijd te gebruiken om te analyseren of valse negatieven worden veroorzaakt door verlies of onvoldoende enzymactiviteit.Opgemerkt moet worden dat soms het Taq-enzym wordt vergeten. Primers: Primerkwaliteit, primerconcentratie en of de concentraties van de twee primers symmetrisch zijn, zijn veelvoorkomende redenen voor PCR-falen of onbevredigende amplificatiebanden en gemakkelijke diffusie.In sommige batches zijn er problemen met de kwaliteit van de primersynthese.Eén van de twee primers heeft een hoge concentratie en de andere een lage concentratie, wat resulteert in asymmetrische amplificatie met lage efficiëntie.
De tegenmaatregelen zijn:
① Selecteer een goede primersynthese-eenheid.
② Bij de concentratie van de primers moet niet alleen naar de OD-waarde worden gekeken, maar ook aandacht worden besteed aan de primervoorraadoplossing voor agarosegelelektroforese.Er moeten primerbanden zijn en de helderheid van de twee primerbanden moet ongeveer hetzelfde zijn.De ene primer heeft bijvoorbeeld een band en de andere primer heeft geen band.Voor strips kan PCR op dit moment mislukken en moet dit worden opgelost door middel van onderhandelingen met de primersynthese-eenheid.Als de ene primer een hoge helderheid heeft en de andere een lage helderheid, breng dan de concentraties in evenwicht bij het verdunnen van de primers.
③ Primers moeten in hoge concentraties en kleine hoeveelheden worden bewaard om herhaald invriezen en ontdooien of langdurige opslag in de koelkast te voorkomen, wat kan leiden tot bederf en afbraak van de primers.
④Het ontwerp van de primer is onredelijk, de lengte van de primer is bijvoorbeeld niet voldoende, er worden dimeren gevormd tussen de primers, enz. Mg2+-concentratie: de Mg2+-ionenconcentratie heeft een grote invloed op de efficiëntie van de PCR-amplificatie.Als de concentratie te hoog is, kan dit de specificiteit van PCR-amplificatie verminderen.Als de concentratie te laag is, zal dit de opbrengst van de PCR-amplificatie beïnvloeden en er zelfs voor zorgen dat de PCR-amplificatie mislukt zonder de banden te versterken.Veranderingen in reactievolume: Gewoonlijk zijn de volumes die worden gebruikt voor PCR-amplificatie 20 µl, 30 µl en 50 µl.Of 100ul, welk volume moet worden gebruikt voor PCR-amplificatie wordt bepaald op basis van verschillende doeleinden van wetenschappelijk onderzoek en klinische tests.Nadat je een klein volume hebt gemaakt, zoals 20ul, en vervolgens een groter volume hebt gemaakt, moet je de voorwaarden volgen, anders mislukt het gemakkelijk.Fysieke redenen: Denaturatie is erg belangrijk voor PCR-amplificatie.Als de denaturatietemperatuur laag is en de denaturatietijd kort, is de kans groot dat er valse negatieven optreden;de uitgloeitemperatuur is te laag, wat niet-specifieke amplificatie kan veroorzaken en de specifieke amplificatie-efficiëntie kan verminderen.De gloeitemperatuur is te hoog.Heeft een grote invloed op de binding van primers aan sjablonen en vermindert de efficiëntie van PCR-amplificatie.Soms is het nodig om een standaardthermometer te gebruiken om de denaturatie-, uitgloei- en verlengingstemperaturen in de versterker of in water oplosbare pot te controleren.Dit is ook een van de redenen voor het mislukken van PCR.Variatie van de doelsequentie: Als de doelsequentie is gemuteerd of verwijderd, wat de specifieke binding van de primer aan de matrijs beïnvloedt, of als de primer en de matrijs de complementaire sequentie verliezen als gevolg van de verwijdering van een bepaald segment van de doelsequentie, is de PCR-amplificatie zal niet succesvol zijn.
2. Vals positief De PCR-amplificatieband die verschijnt komt overeen met de doelsequentieband, en soms is de band ordentelijker en helderder.Ongepast primerontwerp: De geselecteerde amplificatiesequentie heeft homologie met de niet-doelwitamplificatiesequentie, dus bij het uitvoeren van PCR-amplificatie is het geamplificeerde PCR-product een niet-doelwitsequentie.Als de doelsequentie te kort is of de primer te kort is, kunnen er gemakkelijk valse positieven optreden.Primers moeten opnieuw worden ontworpen.Kruisbesmetting van doelsequenties of amplificatieproducten: Er zijn twee redenen voor deze besmetting: Ten eerste kruisbesmetting van het gehele genoom of grote fragmenten, wat leidt tot valse positieven.Dit vals-positieve resultaat kan op de volgende manieren worden opgelost: Wees voorzichtig en voorzichtig tijdens het gebruik om te voorkomen dat de doelsequentie in het monsterpistool wordt gezogen of uit de centrifugebuis spat.Met uitzondering van enzymen en stoffen die niet tegen hoge temperaturen kunnen, moeten alle reagentia of apparatuur onder hoge druk worden gesteriliseerd.Alle centrifugebuisjes en monsterinjectiepipettips moeten één keer worden gebruikt.Indien nodig worden de reactiebuizen en reagentia bestraald met ultraviolet licht voordat het monster wordt toegevoegd om de aanwezige nucleïnezuren te vernietigen.De tweede is de besmetting van kleine fragmenten van nucleïnezuren in de lucht.Deze kleine fragmenten zijn korter dan de doelsequentie, maar hebben een bepaalde homologie.Ze kunnen aan elkaar worden gesplitst en nadat ze complementair zijn aan de primers, kunnen de PCR-producten worden geamplificeerd, wat resulteert in valse positieven, die kunnen worden verminderd of geëlimineerd door geneste PCR-methoden.
3. Er verschijnen niet-specifieke amplificatiebanden De banden die verschijnen na PCR-amplificatie zijn inconsistent met de verwachte grootte, groter of kleiner, of zowel specifieke amplificatiebanden als niet-specifieke amplificatiebanden verschijnen tegelijkertijd.De redenen voor het verschijnen van niet-specifieke banden zijn: ten eerste zijn de primers niet volledig complementair aan de doelsequentie, of aggregeren de primers om dimeren te vormen.De tweede reden is dat de Mg2+-ionenconcentratie te hoog is, de annealingstemperatuur te laag is en het aantal PCR-cycli te hoog is.De tweede factor is de kwaliteit en kwantiteit van het enzym.Enzymen uit sommige bronnen zijn vaak gevoelig voor niet-specifieke banden, maar enzymen uit andere bronnen niet.Overmatige hoeveelheden enzymen kunnen soms leiden tot niet-specifieke amplificatie.De tegenmaatregelen omvatten: herontwerp van primers indien nodig.Verminder de hoeveelheid enzym of vervang het door een andere bron.Verminder de hoeveelheid primers, verhoog de hoeveelheid sjabloon op passende wijze en verminder het aantal cycli.Verhoog de uitgloeitemperatuur op passende wijze of gebruik de puntmethode met twee temperaturen (denaturatie bij 93°C, uitgloeien en verlenging rond 65°C).
4. Er verschijnen schilferige slepen of vegen PCR-amplificatie verschijnt soms als vlekkerige banden, bladachtige banden of tapijtachtige banden.De redenen worden vaak veroorzaakt door te veel enzym of een slechte kwaliteit van het enzym, een te hoge dNTP-concentratie, een te hoge Mg2+-concentratie, een te lage gloeitemperatuur en te veel cycli.De tegenmaatregelen omvatten: ① Verminder de hoeveelheid enzym of vervang het enzym door een andere bron.②Verminder de concentratie van dNTP.Verlaag de Mg2+-concentratie op passende wijze.Vergroot het aantal sjablonen en verminder het aantal cycli