Perguntas frequentes sobre PCR 1. Falso negativo, nenhuma banda de amplificação aparece 2. Falso positivo 3. Aparecem bandas de amplificação não específicas 4. Aparecem tiras de arrasto escamosas ou tiras de esfregaço:
1Falso negativo, nenhuma banda amplificada aparece Os principais aspectos da reação PCR são
① preparação de ácido nucleico modelo
② qualidade e especificidade do primer
③ qualidade enzimática e
④ Condições do ciclo PCR.Para encontrar os motivos, análises e pesquisas também devem ser realizadas nos links acima.
Modelo:
① O modelo contém proteínas de impureza
② O modelo contém inibidores da enzima Taq
③ As proteínas do modelo não são digeridas e removidas, especialmente as histonas nos cromossomos
④ Perdeu-se muita quantidade durante a extração e preparação do molde ou fenol foi inalado
⑤O ácido nucleico modelo não está completamente desnaturado.Quando a qualidade das enzimas e dos primers é boa, se as bandas de amplificação não aparecerem, é mais provável que haja algo errado com o processo de digestão da amostra ou com o processo de extração do ácido nucleico do modelo.Portanto, uma solução de digestão eficaz e estável deve ser preparada, e o procedimento deve ser corrigido e não deve ser alterado à vontade..Inativação enzimática: É necessário substituir a nova enzima ou usar enzimas antigas e novas ao mesmo tempo para analisar se os falsos negativos são causados por perda ou atividade enzimática insuficiente.Deve-se notar que às vezes a enzima Taq é esquecida.Primers: A qualidade do primer, a concentração do primer e se as concentrações dos dois primers são simétricas são razões comuns para falha da PCR ou bandas de amplificação insatisfatórias e fácil difusão.Existem problemas com a qualidade da síntese de primers em alguns lotes.Um dos dois primers tem alta concentração e o outro tem baixa concentração, resultando em amplificação assimétrica de baixa eficiência.
As contramedidas são:
① Selecione uma boa unidade de síntese de primer.
② A concentração dos primers não deve apenas observar o valor de DO, mas também prestar atenção à solução estoque do primer para eletroforese em gel de agarose.Deve haver bandas de primer e o brilho das duas bandas de primer deve ser aproximadamente o mesmo.Por exemplo, um primer possui uma banda e o outro primer não possui banda.Para tiras, a PCR pode falhar neste momento e deve ser resolvida através de negociação com a unidade de síntese de primers.Se um primer tiver alto brilho e o outro tiver baixo brilho, equilibre as concentrações ao diluir os primers.
③ Os primers devem ser armazenados em alta concentração e pequenas quantidades para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos ou armazenamento prolongado na geladeira, o que pode levar à deterioração e degradação dos primers.
④O design do primer não é razoável, como o comprimento do primer não é suficiente, dímeros são formados entre os primers, etc. Concentração de Mg2+: A concentração de íons Mg2+ tem uma grande influência na eficiência da amplificação por PCR.Se a concentração for muito alta, pode reduzir a especificidade da amplificação por PCR.Se a concentração for muito baixa, isso afetará o rendimento da amplificação por PCR e até mesmo fará com que a amplificação por PCR falhe sem amplificar as bandas.Mudanças no volume de reação: Normalmente os volumes utilizados para amplificação por PCR são 20ul, 30ul e 50ul.Ou 100ul, o volume que deve ser usado para amplificação por PCR é definido de acordo com diferentes finalidades de pesquisa científica e testes clínicos.Depois de fazer um volume pequeno, como 20ul, e depois fazer um volume maior, você deve seguir as condições, caso contrário irá falhar facilmente.Razões físicas: A desnaturação é muito importante para a amplificação por PCR.Se a temperatura de desnaturação for baixa e o tempo de desnaturação for curto, é muito provável que ocorram falsos negativos;a temperatura de recozimento é muito baixa, o que pode causar amplificação inespecífica e reduzir a eficiência de amplificação específica.A temperatura de recozimento está muito alta.Afeta altamente a ligação de primers aos modelos e reduz a eficiência da amplificação por PCR.Às vezes é necessário usar um termômetro padrão para verificar as temperaturas de desnaturação, recozimento e extensão no amplificador ou pote solúvel em água.Esta também é uma das razões para a falha do PCR.Variação da sequência alvo: Se a sequência alvo sofrer mutação ou deleção, o que afeta a ligação específica do primer ao molde, ou o primer e o molde perderem a sequência complementar devido à deleção de um determinado segmento da sequência alvo, a amplificação por PCR não terá sucesso.
2.falso positivo A banda de amplificação por PCR que aparece é consistente com a banda da sequência alvo e, às vezes, a banda é mais ordenada e mais brilhante.Desenho inadequado do iniciador: A sequência de amplificação selecionada tem homologia com a sequência de amplificação não alvo, portanto, ao realizar a amplificação por PCR, o produto de PCR amplificado é uma sequência não alvo.Se a sequência alvo for muito curta ou o primer for muito curto, podem ocorrer facilmente falsos positivos.Os primers precisam ser redesenhados.Contaminação cruzada de sequências alvo ou produtos de amplificação: Existem duas razões para esta contaminação: Primeiro, contaminação cruzada de todo o genoma ou de grandes fragmentos, levando a falsos positivos.Este falso positivo pode ser resolvido pelos seguintes métodos: Seja cuidadoso e gentil ao operar para evitar que a sequência alvo seja sugada para dentro da pistola de amostra ou respingada para fora do tubo da centrífuga.Exceto enzimas e substâncias que não suportam altas temperaturas, todos os reagentes ou equipamentos devem ser esterilizados por alta pressão.Todos os tubos de centrífuga e pontas de pipetas de injeção de amostra devem ser usados uma vez.Se necessário, os tubos de reação e os reagentes são irradiados com luz ultravioleta antes de adicionar a amostra para destruir os ácidos nucleicos presentes.A segunda é a contaminação de pequenos fragmentos de ácidos nucléicos no ar.Estes pequenos fragmentos são mais curtos que a sequência alvo, mas possuem certa homologia.Eles podem ser unidos entre si e, após serem complementares aos primers, os produtos de PCR podem ser amplificados, resultando em falsos positivos, que podem ser reduzidos ou eliminados por métodos de nested PCR.
3. Aparecem bandas de amplificação não específicas As bandas que aparecem após a amplificação por PCR são inconsistentes com o tamanho esperado, maiores ou menores, ou ambas as bandas de amplificação específicas e bandas de amplificação não específicas aparecem ao mesmo tempo.As razões para o aparecimento de bandas não específicas são: primeiro, os iniciadores não são completamente complementares à sequência alvo, ou os iniciadores agregam-se para formar dímeros.A segunda razão é que a concentração de íons Mg2+ é muito alta, a temperatura de recozimento é muito baixa e o número de ciclos de PCR é muito alto.O segundo fator é a qualidade e quantidade da enzima.As enzimas de algumas fontes são frequentemente propensas a bandas não específicas, mas as enzimas de outras fontes não.Quantidades excessivas de enzimas podem às vezes levar a amplificações inespecíficas.As contramedidas incluem: redesenhar os primers, se necessário.Reduza a quantidade de enzima ou substitua-a por outra fonte.Reduza a quantidade de primers, aumente a quantidade de modelo adequadamente e reduza o número de ciclos.Aumente a temperatura de recozimento adequadamente ou use o método de dois pontos de temperatura (desnaturação a 93°C, recozimento e extensão em torno de 65°C).
4. Aparecem manchas ou manchas escamosas. A amplificação por PCR às vezes aparece como faixas manchadas, faixas semelhantes a folhas ou faixas semelhantes a carpetes.As razões são frequentemente causadas por excesso de enzima ou má qualidade da enzima, concentração muito alta de dNTP, concentração muito alta de Mg2+, temperatura de recozimento muito baixa e muitos ciclos.As contramedidas incluem: ① Reduzir a quantidade de enzima ou substituir a enzima por outra fonte.②Reduza a concentração de dNTP.Reduza adequadamente a concentração de Mg2+.Aumente a quantidade de templates e reduza o número de ciclos