Întrebări frecvente PCR 1. Fals negativ, nu apare nicio bandă de amplificare 2. Fals pozitiv 3. Apar benzi de amplificare nespecifice 4. Apar benzi de glisare sau benzi de frotiu:
1 Fals negativ, nu apare nicio bandă amplificată Aspectele cheie ale reacției PCR sunt
① prepararea acidului nucleic șablon
② calitatea grundului și specificitatea
③ calitatea enzimelor și
④ Condițiile ciclului PCR.Pentru a găsi motivele, analiza și cercetarea ar trebui efectuate și pe link-urile de mai sus.
Șablon:
① Șablonul conține proteine impurități
② Șablonul conține inhibitori ai enzimei Taq
③ Proteinele din șablon nu sunt digerate și îndepărtate, în special histonele din cromozomi
④ S-a pierdut prea mult în timpul extracției și pregătirii șablonului sau a fost inhalat fenol
⑤Acidul nucleic șablon nu este complet denaturat.Când calitatea enzimelor și primerilor este bună, dacă nu apar benzi de amplificare, cel mai probabil este ceva în neregulă cu procesul de digestie a probei sau cu procesul de extracție a acidului nucleic șablon.Prin urmare, trebuie pregătită o soluție de digestie eficientă și stabilă, iar procedura trebuie fixată și nu trebuie schimbată după bunul plac..Inactivarea enzimei: este necesar să se înlocuiască noua enzimă sau să se folosească atât enzime vechi, cât și noi în același timp pentru a analiza dacă fals negative sunt cauzate de pierderea sau de activitatea insuficientă a enzimei.Trebuie remarcat faptul că uneori enzima Taq este uitată.Primeri: calitatea primerului, concentrația primerului și dacă concentrațiile celor doi primeri sunt simetrice sunt motive comune pentru eșecul PCR sau benzi de amplificare nesatisfăcătoare și difuzie ușoară.Există probleme cu calitatea sintezei primerului în unele loturi.Unul dintre cei doi primeri are o concentrație mare, iar celălalt are o concentrație scăzută, rezultând o amplificare asimetrică cu eficiență scăzută.
Contramăsurile sunt:
① Selectați o unitate bună de sinteză a primerului.
② Concentrația de primeri nu ar trebui să se uite doar la valoarea OD, ci și să acorde atenție soluției stoc de primer pentru electroforeza pe gel de agaroză.Trebuie să existe benzi de amorsare, iar luminozitatea celor două benzi de amorsare ar trebui să fie aproximativ aceeași.De exemplu, un primer are o bandă, iar celălalt primer nu are bandă.Pentru benzi, PCR poate eșua în acest moment și ar trebui rezolvată prin negociere cu unitatea de sinteză a primerului.Dacă un primer are luminozitate mare, iar celălalt are luminozitate scăzută, echilibrați concentrațiile atunci când diluați grundule.
③ Grundurile trebuie depozitate în concentrație mare și în cantități mici pentru a preveni înghețarea și dezghețarea repetă sau depozitarea pe termen lung în frigider, ceea ce poate duce la deteriorarea și degradarea grundurilor.
④Designul primerului este nerezonabil, cum ar fi lungimea primerului nu este suficientă, se formează dimeri între primeri etc. Concentrația Mg2+: concentrația ionului Mg2+ are o mare influență asupra eficienței amplificării PCR.Dacă concentrația este prea mare, poate reduce specificitatea amplificării PCR.Dacă concentrația este prea scăzută, aceasta va afecta randamentul amplificării PCR și chiar va cauza eșecul amplificarii PCR fără benzi de amplificare.Modificări ale volumului de reacție: De obicei, volumele utilizate pentru amplificarea PCR sunt 20ul, 30ul și 50ul.Sau 100ul, ce volum ar trebui utilizat pentru amplificarea PCR este stabilit în funcție de diferite scopuri de cercetare științifică și testare clinică.După ce faceți un volum mic, cum ar fi 20ul, și apoi faceți un volum mai mare, trebuie să respectați condițiile, altfel va eșua ușor.Motive fizice: Denaturarea este foarte importantă pentru amplificarea PCR.Dacă temperatura de denaturare este scăzută și timpul de denaturare este scurt, este foarte probabil să apară fals negative;temperatura de recoacere este prea scăzută, ceea ce poate provoca o amplificare nespecifică și poate reduce eficiența specifică de amplificare.Temperatura de recoacere este prea mare.Afectează foarte mult legarea primerilor de șabloane și reduce eficiența amplificării PCR.Uneori este necesar să folosiți un termometru standard pentru a verifica temperaturile de denaturare, recoacere și extindere în amplificator sau oală solubilă în apă.Acesta este, de asemenea, unul dintre motivele eșecului PCR.Variația secvenței țintă: Dacă secvența țintă este mutată sau ștearsă, ceea ce afectează legarea specifică a primerului de șablon, sau primerul și șablonul pierd secvența complementară din cauza ștergerii unui anumit segment al secvenței țintă, amplificarea PCR nu va avea succes.
2.fals pozitiv Banda de amplificare PCR care apare este în concordanță cu banda secvenței țintă, iar uneori banda este mai ordonată și mai luminoasă.Design inadecvat al primerului: Secvența de amplificare selectată are omologie cu secvența de amplificare non-țintă, astfel încât atunci când se efectuează amplificarea PCR, produsul PCR amplificat este o secvență non-țintă.Dacă secvența țintă este prea scurtă sau primerul este prea scurt, pot apărea cu ușurință rezultate false pozitive.Amorsele trebuie reproiectate.Contaminarea încrucișată a secvențelor țintă sau a produselor de amplificare: Există două motive pentru această contaminare: În primul rând, contaminarea încrucișată a întregului genom sau a fragmentelor mari, care duce la fals pozitive.Acest fals pozitiv poate fi rezolvat prin următoarele metode: Fiți atenți și blând atunci când operați pentru a preveni aspirarea secvenței țintă în pistolul de probă sau stropirea din tubul centrifugei.Cu excepția enzimelor și substanțelor care nu pot rezista la temperaturi ridicate, toți reactivii sau echipamentele trebuie sterilizate la presiune înaltă.Toate tuburile de centrifugare și vârfurile pipetei de injectare a probei trebuie utilizate o singură dată.Dacă este necesar, tuburile de reacție și reactivii sunt iradiați cu lumină ultravioletă înainte de adăugarea probei pentru a distruge acizii nucleici prezenți.A doua este contaminarea micilor fragmente de acizi nucleici din aer.Aceste fragmente mici sunt mai scurte decât secvența țintă, dar au o anumită omologie.Ele pot fi îmbinate între ele, iar după ce sunt complementare cu primerii, produsele PCR pot fi amplificate, rezultând fals pozitive, care pot fi reduse sau eliminate prin metode PCR imbricate.
3. Apar benzi de amplificare nespecifice Benzile care apar după amplificarea PCR sunt inconsecvente cu dimensiunea așteptată, fie mai mare, fie mai mică, sau ambele benzi de amplificare specifice și benzi de amplificare nespecifice apar în același timp.Motivele apariției benzilor nespecifice sunt: în primul rând, primerii nu sunt complet complementari cu secvența țintă sau primerii se agregează pentru a forma dimeri.Al doilea motiv este că concentrația de ioni Mg2+ este prea mare, temperatura de recoacere este prea scăzută și numărul de cicluri PCR este prea mare.Al doilea factor este calitatea și cantitatea enzimei.Enzimele din unele surse sunt adesea predispuse la benzi nespecifice, dar enzimele din alte surse nu.Cantitățile excesive de enzime pot duce uneori la amplificare nespecifică.Contramăsurile includ: reproiectarea grundurilor dacă este necesar.Reduceți cantitatea de enzimă sau înlocuiți-o cu o altă sursă.Reduceți cantitatea de primeri, creșteți cantitatea de șablon în mod corespunzător și reduceți numărul de cicluri.Creșteți temperatura de recoacere în mod corespunzător sau utilizați metoda cu două puncte de temperatură (denaturare la 93°C, recoacere și extindere în jur de 65°C).
4.Faky drag sau frotiuri apar Amplificarea PCR apare uneori ca benzi mânjite, benzi sub formă de foi sau benzi asemănătoare covorului.Motivele sunt adesea cauzate de prea multă enzimă sau de calitatea slabă a enzimei, concentrație prea mare de dNTP, concentrație prea mare de Mg2+, temperatură de recoacere prea scăzută și prea multe cicluri.Contramăsurile includ: ① Reduceți cantitatea de enzimă sau înlocuiți enzima cu o altă sursă.②Reduceți concentrația de dNTP.Reduceți în mod corespunzător concentrația de Mg2+.Măriți numărul de șabloane și reduceți numărul de cicluri