PCR FAQ 1. Been taban, ma muuqato band dhawaaq-weyneyn

1Negative been ah, ma muuqato band la xoojiyay Dhinacyada muhiimka ah ee falcelinta PCR waa

① diyaarinta template nucleic acid

② tayada asaasiga ah iyo gaar ahaaneed

③ tayada enzyme iyo

④ Xaaladaha wareegga PCR.Si loo helo sababaha, falanqaynta iyo cilmi-baarista waa in sidoo kale lagu sameeyaa xiriirka sare.

Qaabka:

① Qaab-dhismeedka waxa ka kooban borotiinno wasakhaysan

② Qaab-dhismeedka waxaa ka kooban Taq enzyme inhibitors

③ Barootiinnada ku jira qaab-dhismeedka lama dheefshiido lamana saaro, gaar ahaan histones-yada ku jira koromosoomyada.

④ Wax badan ayaa lumay inta lagu jiro soo saarista iyo diyaarinta template, ama phenol waa la nuugay

⑤ Qaabka loo yaqaan 'nucleic acid' ma aha mid gebi ahaanba laga saaray.Marka tayada ensaymyada iyo kuwa asaasiga ah ay wanaagsan yihiin, haddii xargaha kor u qaadista aysan muuqan, waxay u badan tahay inay wax ka qaldan yihiin habka dheefshiidka ee muunada ama habka soo saarista aashitada nucleic.Sidaa darteed, waa in la diyaariyaa xal dheef-shiid kiimikaad oo waxtar leh oo xasilloon, habraacuna waa in la hagaajiyaa oo aan la beddelin sida la doono..Dhaqdhaqaaq la'aanta Enzyme: Waa lagama maarmaan in la beddelo ensaymka cusub, ama la isticmaalo labadaba duugoobay iyo kuwa cusub isku mar si loo falanqeeyo haddii xumaanta beenta ah ay sababto luminta ama waxqabadka enzyme-ka oo aan ku filnayn.Waa in la ogaadaa in mararka qaarkood enzyme Taq la iloobo. Aasaasayaasha: tayada Primer, feejignaanta asaasiga ah, iyo haddii isku-darka labada asaasiga ah ay yihiin kuwo simmetrical ah ayaa ah sababaha caadiga ah ee PCR-ga fashilka ama xirmooyinka xoojinta ee aan ku qanacsanayn iyo faafinta sahlan.Waxaa jira dhibaatooyin xagga tayada isku-dhafka asaasiga ah ee dufcadaha qaarkood.Mid ka mid ah labada asaasiga ah ayaa leh feejignaan sare, kan kalena wuxuu leeyahay feejignaan hoose, taasoo keentay hoos u dhigista waxtarka asymmetric.

Tallaabooyinka liddi ku ah waa:

① Dooro unug falanqeyn aasaasi ah oo wanaagsan.

② Diiradda asaasiga ah waa inaysan eegin oo kaliya qiimaha OD, laakiin sidoo kale fiiro gaar ah u yeelo xalka kaydka asaasiga ah ee agarose gel electrophoresis.Waa in ay jiraan xargaha asaasiga ah, iyo dhalaalka labada qaybood ee asaasiga ah waa in ay qiyaas ahaan isku mid noqdaan.Tusaale ahaan, hal bareer ayaa leh band, kan kalena ma laha wax faashad ah.Xariijimaha, PCR waxa laga yaabaa inay ku guul darreysato wakhtigan oo waa in lagu xalliyo wada xaajood lala yeesho unugga isku-darka asaasiga ah.Haddii mid ka mid ah asaasiga ahi uu leeyahay dhalaal sare, kan kalena uu leeyahay dhalaal hooseeya, dheelli tirnaanta marka la milmaynayo asaasiga.

③ Furayaasha waa in lagu kaydiyaa xoog badan iyo tiro yar si looga hortago qaboojinta soo noqnoqda iyo dhalaalidda ama kaydinta muddada dheer ee talaajadda, taas oo u horseedi karta xumaan iyo hoos u dhac ku yimaada aasaasayaasha.

④ Naqshadaynta asaasiga ahi waa mid aan caqli-gal ahayn, sida dhererka asaasiga ah kuma filna, dimers ayaa laga sameeyay inta u dhaxaysa aasaasayaasha, iwm. Mg2 + xoojinta: Mg2 + ion ion waxay saameyn weyn ku leedahay waxtarka xoojinta PCR.Haddii xooga saariddu aad u sarreyso, waxay yarayn kartaa gaar ahaan-weynaynta PCR.Haddii xooga saaridu aad u hooseyso, waxay saameyn doontaa wax-soo-saarka PCR-ga oo xittaa waxay sababi doontaa in kor-u-qaadista PCR-ga ay fashilanto iyada oo aan la kordhin xargaha.Isbeddelka mugga falcelinta: Caadiyan mugga loo isticmaalo kordhinta PCR waa 20ul, 30ul, iyo 50ul.Ama 100ul, mugga noocee ah ayaa loo isticmaali karaa kordhinta PCR ayaa loo dejiyay iyadoo loo eegayo ujeedooyinka kala duwan ee cilmi-baarista sayniska iyo baaritaanka bukaan-socodka.Kadib samaynta mug yar, sida 20ul, ka dibna samaynta mugga weyn, waa inaad raacdaa shuruudaha, haddii kale si fudud ayay u dhici doontaa.Sababaha jireed: Denaturation aad ayey muhiim ugu tahay kordhinta PCR.Haddii heerkulka denaturation uu hooseeyo oo wakhtiga denaturation uu gaaban yahay, xumaanta beenta ah waxay u badan tahay inay dhacaan;heerkulka annealing aad ayuu u hooseeyaa, taas oo keeni karta kordhin aan gaar ahayn oo hoos u dhigi kartaa waxtarka weyneynta gaarka ah.Heerkulka xajinta ayaa aad u sarreeya.Waxay si aad ah u saamaysaa ku-xidhka aasaasiga ah ee qaab-dhismeedka waxayna yaraynaysaa waxtarka kordhinta PCR.Mararka qaarkood waxaa lagama maarmaan ah in la isticmaalo heerkulbeegga caadiga ah si loo hubiyo heerkulka diidmada, ka saarista iyo fidinta heerkulka cod-weyneeye ama dheriga biyaha-milmi kara.Tani sidoo kale waa mid ka mid ah sababaha PCR guuldarada.Kala duwanaanshiyaha isku xigxiga yoolka: Haddii taxanaha bartilmaameedka la beddelo ama la tirtiro, taas oo saameynaysa ku-xidhka gaarka ah ee asaasiga ah ee template, ama furaha iyo template lumin taxanaha dhammaystirka ah sababtoo ah tirtirka qayb gaar ah oo ka mid ah taxanaha bartilmaameedka, kordhinta PCR ma guulaysan doono.

2.false positive Kooxda-weynaynta PCR ee soo muuqata waxay la socotaa guutada taxanaha ah ee la beegsanayo, marmarka qaarkoodna kooxdu aad ayay u nidaamsan tahay oo u ifaysaa.Nakhshad aan habboonayn: Taxanaha cod-weyneysiinta ee la xushay waxa uu leeyahay isku-dhafan oo leh tix-weynaynta aan bartilmaameedka ahayn, markaa marka la samaynayo kor-u-qaadista PCR, badeecada PCR ee la xoojiyay waa taxane aan bartilmaameed ahayn.Haddi isku xigxiga yoolku uu aad u gaaban yahay ama qoruhu uu aad u gaaban yahay, waxaa laga yaabaa inay si fudud u dhacaan natiijooyin been abuur ah.Furayaasha u baahan in dib loo habeeyo.Wasakhaynta is-dhaafsiga ee taxanaha bartilmaameedka ama alaabada xoojinta: Waxaa jira laba sababood oo wasakhowgan ah: Marka hore, wasakheynta guud ee genome-ga ama jajabyada waaweyn, taasoo keenta natiijooyin been abuur ah.Wanaaggan beenta ah waxaa lagu xallin karaa hababka soo socda: Taxadir oo si tartiib ah marka aad shaqaynayso si aad uga hortagto in taxanaha bartilmaameedka lagu dhuuqo qoriga muunada ama laga soo daadiyo tuubada centrifuge.Marka laga reebo ensaymes iyo walxaha aan u adkeysan karin heerkulka sare, dhammaan reagen-yada ama qalabka waa in lagu nadiifiyaa cadaadis sare.Dhammaan tuubooyinka centrifuge iyo talooyinka pipette ee muunada muunada waa in la isticmaalo hal mar.Haddii loo baahdo, tuubooyinka falcelinta iyo reagents ayaa lagu shubaa iftiinka ultraviolet ka hor inta aan lagu darin muunada si loo burburiyo asiidhyada nucleic-ka ah ee jooga.Midda labaad waa wasakhaynta jajabyada yaryar ee asiidhyada nucleic-ka ah ee hawada.Jajabyadan yar yar way ka gaaban yihiin isku xigxiga la beegsanayo, laakiin waxay leeyihiin wax isku mid ah.Waa la kala qaybin karaa midba midka kale, ka dib marka la dhamaystiro aasaasayaasha, alaabta PCR waa la kordhin karaa, taas oo keeneysa natiijooyin been abuur ah, taas oo la dhimi karo ama la tirtiri karo hababka PCR ee buulka leh.

 

3.Xubnadaha cod-weyneysiinta ee aan-gaarka ahayn ayaa soo muuqda Xargaha soo muuqda ka dib kordhinta PCR waa kuwo aan ku habboonayn cabbirka la filayo, ama ka weyn ama ka yar, ama labada qaybood ee cod-weyneysiinta gaarka ah iyo kuwa aan khaaska ahayn waxay muuqdaan isku mar.Sababaha soo ifbaxaya xargaha aan gaarka ahayn waa: marka hore, furayaasha si buuxda uma dhamaystiraan isku xigxiga bartilmaameedka, ama furayaasha ayaa isu geynaya inay sameeyaan dimers.Sababta labaad ayaa ah in fiirsashada Mg2+ ion ay aad u sarreyso, heerkulka xajintu aad ayuu u hooseeyaa, tirada wareegyada PCR-ga ayaa aad u sarreeya.Qodobka labaad waa tayada iyo tirada enzyme-ka.Enzymes-ka ilaha qaar ayaa inta badan u nugul xirmooyinka aan khaaska ahayn laakiin ensaymes-yada ilo kale maaha.Xaddiga xad-dhaafka ah ee enzymes-ku waxay mararka qaarkood u horseedi karaan kordhin aan gaar ahayn.Tallaabooyinka ka-hortagga waxaa ka mid ah: dib-u-habeeynta aasaasiga ah haddii loo baahdo.Iska yaree qadarka enzyme ama ku beddel il kale.Iska yaree qaddarka furayaasha, kordhi tirada template si habboon, oo yaree tirada wareegyada.Si habboon u kordhi heerkulka soo-jiidashada ama isticmaal habka dhibcaha heerkulka-labada ah (denaturation at 93°C, bajinta iyo kordhinta agagaarka 65°C).

 

4. Jiid jilicsan ama smears waxay u muuqdaan kor u qaadida PCR mararka qaarkood waxay u muuqataa sida xargaha la mariyo, xargaha xaashida u eg ama rooga u eg.Sababaha waxaa badanaa keena ensaymes aad u badan ama tayada ensaymka oo liidata, fiirsashada dNTP oo aad u sareysa, fiirsashada Mg2+ aad u sareysa, heerkul aad u hooseeya, iyo wareegyo aad u badan.Tallaabooyinka ka-hortagga waxaa ka mid ah: ① Yaree qaddarka enzyme, ama ku beddel enzyme-ka il kale.②Yaree diirada dNTP.Si habboon u dhimo fiirsashada Mg2+.Kordhi tirada qaab-dhismeedka oo yaree tirada wareegyada