PCR FAQ 1. Falskt negativt, inget amplifieringsband visas 2. Falskt positivt 3. Ospecifika amplifieringsband visas 4. Flakiga dragremsor eller utstryksremsor visas:
1 Falskt negativt, inget amplifierat band visas Nyckelaspekterna av PCR-reaktionen är
① beredning av mallnukleinsyra
② primerkvalitet och specificitet
③ enzym kvalitet och
④ PCR-cykelförhållanden.För att hitta orsakerna bör analys och forskning också utföras på ovanstående länkar.
Mall:
① Mallen innehåller föroreningsproteiner
② Mallen innehåller Taq-enzymhämmare
③ Proteinerna i mallen smälts inte och tas bort, särskilt histonerna i kromosomerna
④ För mycket förlorades under extraheringen och beredningen av mallen, eller så inhalerades fenol
⑤ Templatnukleinsyran är inte fullständigt denaturerad.När kvaliteten på enzymer och primrar är bra, om amplifieringsband inte uppträder, är det mest troligt att det är något fel med digestionsprocessen av provet eller mallnukleinsyraextraktionsprocessen.Därför måste en effektiv och stabil matsmältningslösning förberedas, och proceduren bör fixas och bör inte ändras efter behag..Enzyminaktivering: Det är nödvändigt att ersätta det nya enzymet, eller använda både gamla och nya enzymer samtidigt för att analysera om falska negativa effekter orsakas av förlust eller otillräcklig enzymaktivitet.Det bör noteras att Taq-enzymet ibland glöms bort. Primers: Primerkvalitet, primerkoncentration och om koncentrationerna av de två primrarna är symmetriska är vanliga orsaker till PCR-fel eller otillfredsställande amplifieringsband och lätt diffusion.Det finns problem med kvaliteten på primersyntesen i vissa partier.En av de två primrarna har en hög koncentration och den andra har en låg koncentration, vilket resulterar i lågeffektiv asymmetrisk amplifiering.
Motåtgärderna är:
① Välj en bra primersyntesenhet.
② Koncentrationen av primers bör inte bara titta på OD-värdet, utan också vara uppmärksam på primerns stamlösning för agarosgelelektrofores.Det måste finnas primerband och ljusstyrkan på de två primerbanden bör vara ungefär densamma.Till exempel har en primer ett band och den andra primern har inget band.För remsor kan PCR misslyckas vid denna tidpunkt och bör lösas genom förhandlingar med primersyntesenheten.Om en primer har hög ljusstyrka och den andra har låg ljusstyrka, balansera koncentrationerna vid spädning av primers.
③ Primers bör förvaras i hög koncentration och små mängder för att förhindra upprepad frysning och upptining eller långtidsförvaring i kylskåp, vilket kan leda till försämring och nedbrytning av primers.
④Primerdesignen är orimlig, som att primerlängden inte räcker till, dimerer bildas mellan primrar, etc. Mg2+-koncentration: Mg2+-jonkoncentration har stor inverkan på PCR-amplifieringseffektiviteten.Om koncentrationen är för hög kan det minska specificiteten för PCR-amplifiering.Om koncentrationen är för låg kommer det att påverka PCR-amplifieringsutbytet och till och med göra att PCR-amplifieringen misslyckas utan amplifieringsband.Förändringar i reaktionsvolym: Vanligtvis är volymerna som används för PCR-amplifiering 20 ul, 30 ul och 50 ul.Eller 100ul, vilken volym som ska användas för PCR-amplifiering ställs in efter olika syften med vetenskaplig forskning och klinisk testning.Efter att ha gjort en liten volym, till exempel 20ul, och sedan gjort en större volym, måste du följa villkoren, annars kommer det lätt att misslyckas.Fysiska skäl: Denaturering är mycket viktig för PCR-amplifiering.Om denatureringstemperaturen är låg och denatureringstiden är kort är det mycket sannolikt att falska negativa effekter uppstår;glödgningstemperaturen är för låg, vilket kan orsaka ospecifik amplifiering och minska den specifika amplifieringseffektiviteten.Glödgningstemperaturen är för hög.Påverkar starkt bindningen av primrar till mallar och minskar PCR-amplifieringseffektiviteten.Ibland är det nödvändigt att använda en standardtermometer för att kontrollera denaturerings-, glödgnings- och förlängningstemperaturerna i förstärkaren eller den vattenlösliga potten.Detta är också en av anledningarna till PCR-fel.Målsekvensvariation: Om målsekvensen är muterad eller deleterad, vilket påverkar den specifika bindningen av primern till mallen, eller om primern och mallen förlorar den komplementära sekvensen på grund av deletionen av ett visst segment av målsekvensen, kommer PCR-amplifieringen kommer inte att lyckas.
2. Falskt positivt PCR-amplifieringsbandet som visas överensstämmer med målsekvensbandet, och ibland är bandet mer ordnat och ljusare.Olämplig primerdesign: Den valda amplifieringssekvensen har homologi med icke-målamplifieringssekvensen, så när man utför PCR-amplifiering är den amplifierade PCR-produkten en icke-målsekvens.Om målsekvensen är för kort eller primern är för kort, kan falska positiva lätt uppstå.Primers måste designas om.Korskontaminering av målsekvenser eller amplifieringsprodukter: Det finns två orsaker till denna kontaminering: För det första korskontaminering av hela genomet eller stora fragment, vilket leder till falska positiva resultat.Denna falska positiva kan lösas med följande metoder: Var försiktig och försiktig när du arbetar för att förhindra att målsekvensen sugs in i provpistolen eller stänker ut ur centrifugröret.Förutom enzymer och ämnen som inte tål höga temperaturer, bör alla reagenser eller utrustning steriliseras med högt tryck.Alla centrifugrör och provinjektionspipettspetsar ska användas en gång.Vid behov bestrålas reaktionsrören och reagenserna med ultraviolett ljus innan provet tillsätts för att förstöra de närvarande nukleinsyrorna.Den andra är kontamineringen av små fragment av nukleinsyror i luften.Dessa små fragment är kortare än målsekvensen, men har viss homologi.De kan splitsas till varandra, och efter att ha varit komplementära till primrarna kan PCR-produkterna amplifieras, vilket resulterar i falska positiva resultat, som kan reduceras eller elimineras med kapslade PCR-metoder.
3. Icke-specifika amplifieringsband visas. De band som uppträder efter PCR-amplifiering är oförenliga med den förväntade storleken, antingen större eller mindre, eller så visas både specifika amplifieringsband och icke-specifika amplifieringsband samtidigt.Orsakerna till uppkomsten av icke-specifika band är: för det första är primrarna inte helt komplementära till målsekvensen, eller primrarna aggregerar för att bilda dimerer.Det andra skälet är att Mg2+-jonkoncentrationen är för hög, glödgningstemperaturen är för låg och antalet PCR-cykler är för högt.Den andra faktorn är kvaliteten och kvantiteten av enzymet.Enzymer från vissa källor är ofta benägna att få ospecifika band men enzymer från andra källor gör det inte.För stora mängder enzymer kan ibland leda till ospecifik amplifiering.Motåtgärderna inkluderar: redesign primers vid behov.Minska mängden enzym eller ersätt det med en annan källa.Minska mängden primers, öka mängden mall på lämpligt sätt och minska antalet cykler.Öka glödgningstemperaturen på lämpligt sätt eller använd tvåtemperaturpunktsmetoden (denaturering vid 93°C, glödgning och förlängning runt 65°C).
4. Flaky drag eller utstryk uppträder PCR-förstärkning uppträder ibland som utsmetade band, arkliknande band eller mattliknande band.Orsakerna beror ofta på för mycket enzym eller dålig kvalitet på enzymet, för hög dNTP-koncentration, för hög Mg2+-koncentration, för låg hybridiseringstemperatur och för många cykler.Motåtgärderna inkluderar: ① Minska mängden enzym, eller ersätt enzymet med en annan källa.②Minska koncentrationen av dNTP.Minska Mg2+-koncentrationen på lämpligt sätt.Öka antalet mallar och minska antalet cykler